葡萄愈傷組織中白藜蘆醇含量的影響因素

鐘英英++黃禧擎++凌秋萍++羅鈺沁+羅思成++梁瓊鋒

摘要：以葡萄的葉片、葉柄及莖段誘導的愈傷組織為試驗材料，考察紫外線照射、硝酸銀處理和雜菌污染對其愈傷組織中白藜蘆醇含量的影響。結果表明：經硝酸銀處理的愈傷組織中白藜蘆醇含量隨處理濃度的提高呈現先增加后減少的變化趨勢，在濃度為10 mg/L時，白藜蘆醇含量達到最大；經紫外線照射的愈傷組織中白藜蘆醇含量隨照射時間的延長先增加后減少，莖段與葉片經紫外線照射3 min后白藜蘆醇的含量最高，而葉柄經紫外處理5 min后白藜蘆醇的含量最高。染菌的愈傷組織中白藜蘆醇含量也明顯高于對照。因此，在所試驗的范圍內提高葡萄愈傷組織中白藜蘆醇含量，硝酸銀的適宜濃度為10 mg/L，紫外線照射時間為3～5 min，另外雜菌感染也有助于葡萄愈傷組織中白藜蘆醇含量的提高。

關鍵詞：葡萄；愈傷組織；白藜蘆醇；硝酸銀；紫外線輻照

中圖分類號： S663.101文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0406-02

收稿日期：2015-04-20

基金項目：國家級大學生創新創業計劃；廣西壯族自治區大學生創新創業計劃。

作者簡介：鐘英英（1979—），女，廣西柳州人，碩士，講師，主要從事天然產物提取及利用方面的研究。Tel：（0772）2687033；E-mail：mininetzhkitty@126.com。白藜蘆醇是最先在葡萄屬植物中發現的一種抗逆性物質，是植物體在惡劣環境下或遇到病原微生物侵害時自身分泌的一種抗毒素。目前，可提取白藜蘆醇的原料主要來自葡萄、虎杖、桑樹、花生等植物，在葡萄屬植物中含量最高，由于其具有抗氧化、抗癌、保護心血管等作用而備受關注[1-2]。目前白藜蘆醇的提取主要依靠葡萄皮、虎杖等[2-3]，要滿足白藜蘆醇日益增長的市場需要，需要消耗大量的原料，對環境及野生資源的破壞很大。而利用植物細胞培養生產次生代謝產物具有成本低、周期短、不破壞自然資源、不受季節限制等優勢，為白藜蘆醇生產提供了新途徑。本試驗研究AgNO3和紫外光照對葡萄愈傷組織白藜蘆醇積累的影響，以期找到從葡萄愈傷組織中提取白藜蘆醇的最佳條件，為葡萄愈傷組織中白藜蘆醇的大規模生產和產業化開發提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

試驗用的葡萄葉柄、莖段和葉片等材料取自當地葡萄園；白藜蘆醇對照品購于四川成都曼斯特生物科技公司；MS培養基、NAA、6-BA等均購自浙江臨安木木生物有限公司。

1.2方法

1.2.1葡萄愈傷組織的培養選取無病害葡萄葉柄、葉片和莖段，用低濃度的洗衣粉浸泡30 min，在無菌超凈臺下，用75%乙醇消毒30 s，用1% NaClO3 浸泡1～2 min，再用無菌蒸餾水沖洗數次；將葉片剪成約0.5 cm×0.5 cm的片段，葉柄、莖段則切成0.3～0.5 cm長的小段，接種于MS培養基（含 2 mg/L NAA+0.3 mg/L 6-BA，pH值為5.8）中，（26±1） ℃進行暗培養，每個月繼代培養1次。

1.2.2不同濃度的AgNO3處理將繼代培養的愈傷組織分別轉移到質量濃度為0、1、10、30 mg/L AgNO3的繼代培養基MS（2 mg/L NAA+0.3 mg/L 6-BA，pH值5.8）中，每個濃度3個重復，（26±1） ℃繼續進行暗培養30 d備用。

1.2.3紫外光處理將繼代培養的愈傷組織在紫外燈下分別照射0、1、3、5、10、15 min，每個處理3個重復，照射后繼續在（26±1） ℃暗培養30 d備用。

1.2.4染菌處理將繼代培養的愈傷組織轉移至有培養基的廣口瓶后敞開20 min，然后繼續蓋上，（26±1） ℃暗培養30 d備用。同時，用正常培養的愈傷組織作對照，處理和對照均進行9次重復。

1.2.5白藜蘆醇含量的測定（1）白藜蘆醇標準曲線的制作。精確稱取2.0 mg白藜蘆醇對照品，用甲醇在10 mL容量瓶中混勻，定容得到0.2 mg/mL標準溶液，再將其稀釋至質量濃度分別為2、4、6、8、10、12、14、16 ug/mL的溶液。以濃度為0作空白，用紫外可見分光光度計在306 nm處分別測出各濃度的吸光度，以吸光度為縱坐標、濃度為橫坐標作標準曲線及回歸方程。

（2）白藜蘆醇提取及含量計算。將愈傷組織烘至恒質量，研磨至粉后，精確稱取2.000 g，轉移至50 mL圓底燒瓶中，以料液比為1 g ∶ 20 mL加入70%甲醇，60 ℃恒溫回流提取2 h。之后將所得溶液進行真空抽濾，洗滌2次，合并洗滌液和濾液，記錄體積，取2 mL樣品加70%甲醇至10 mL，用紫外可見分光光度計在306 nm處分別測出各提取液的吸光度，按照下式計算白藜蘆醇的含量（mg/g）：

白藜蘆醇含量=C×V×D/（103×m）。

式中：C為查標準曲線樣品液吸光度對應的白藜蘆醇的濃度，μg/mL；V為樣品溶液的體積，mL；m為樣品稱取的質量，g；D為樣品溶液稀釋倍數。

1.2.6統計學分析不同組織來源的愈傷組織中白藜蘆醇含量的單向方差分析以及染菌與對照樣本的獨立樣本t檢驗，均用SPSS 20.0進行分析。

2結果與分析

2.1標準曲線

由“1.2.5”節中標準曲線制作方法，得到回歸方程為y=0.142 8x+0.137 2，r2=0.996 1，表明白藜蘆醇濃度在2～16 μg/mL 間呈線性關系（圖1）。

2.2AgNO3濃度對葡萄愈傷組織白藜蘆醇含量的影響

由圖2可知，隨AgNO3濃度的提高，白藜蘆醇含量呈先上升后又逐漸下降的趨勢，這與張真等的研究結果[4]類似。當AgNO3濃度為10 mg/L時，白藜蘆醇含量達最大，此時莖段、葉片和葉柄誘導的愈傷組織中白藜蘆醇含量分別為2669、2.926、3.011 mg/g，均明顯高于未處理的 1.562、1786、1.159 mg/g；但隨著AgNO3濃度的升高，白藜蘆醇含量開始下降，當AgNO3濃度達到30 mg/L時，莖段、葉片和葉柄誘導的愈傷組織中白藜蘆醇含量分別下降至 1.230、1238、1063 mg/g。因此，濃度低于10 mg/L的AgNO3能夠促進白藜蘆醇的生成，而濃度超過10 mg/L的AgNO3則會抑制其積累。

白藜蘆醇是植物在惡劣環境下或遇到病原微生物侵害時自身產生的一種抗逆性物質。低濃度銀離子存在時，植物體可能為了消除銀離子的傷害，從而刺激生物體合成更多的抗逆性物質[5]。當硝酸銀濃度過高時，則可能會使細胞受到毒害，抑制白藜蘆醇的生成。其中的原因可能是離體植物細胞會產生并積累乙烯，Ag+通過競爭性結合細胞膜上的乙烯受體蛋白，抑制乙烯的活性，繼而抑制愈傷組織形成[6]。另外，重金屬脅迫可能導致活性氧自由基在植物細胞內增多，其強氧化性對許多生物功能分子造成破壞，從而使細胞的生長受到影響[4]。

2.3紫外線照射對葡萄愈傷組織白藜蘆醇含量的影響

如圖3所示，隨著紫外線照射時間的延長，葡萄不同組織誘導的愈傷組織中白藜蘆醇含量呈現先上升隨后又逐漸下降的趨勢。經紫外光輻射3～5 min的愈傷組織中，白藜蘆醇含量較高。其中，莖段和葉片誘導的愈傷組織經輻照3 min后白藜蘆醇的含量最高，達到2.543、2.180 mg/g，分別為對照組（莖段1.562 mg/g，葉片1.786 mg/g）的1.63、1.22倍；葉柄誘導的愈傷組織則在輻照5 min處理組中的白藜蘆醇含量最高（1.446 mg/g），為對照組（1.159 mg/g）的1.25倍。但當輻照時間超過15 min時，葡萄愈傷組織中的白藜蘆醇含量均低于對照，莖段、葉片、葉柄來源的愈傷組織中白藜蘆醇含量分別比對照下降了11.7%、41.8%、11.3%，葉片誘導的愈傷組織受到的影響最大。

白藜蘆醇為芪類次生代謝物，芪合酶（stilbene synthase， STS）是白藜蘆醇生物合成過程中的關鍵酶[6-7]。Fritzemeier等發現，紫外光照射可顯著提高葡萄葉片的STS 活性，與白藜蘆醇生物合成相關的另外2種酶（苯丙氨酸解氨酶和肉桂酸-4-羥化酶）也同時被誘導[8]。Bruno等也研究發現，北美沙地葡萄品種（Vitis rupestris）在紫外誘導2 h后，STS mRNA持續高水平表達，白藜蘆醇含量也急劇增加[9]。本研究結果表明，少于5 min的紫外光照射可提高葡萄愈傷組織中的白藜蘆醇含量。然而，紫外光輻射也是一種環境脅迫因子，過度照射可能會導致細胞損傷并影響白藜蘆醇等代謝物的生成。

2.4染菌對白藜蘆醇含量的影響

從圖4可以看出，正常的愈傷組織中，莖段來源的白藜蘆醇含量最高（9次重復均值達到1.95 mg/g），其次為葉片愈傷組織（1.79 mg/g），含量最低的為葉柄愈傷組織（1.51 mg/g），但是不同組織之間的白藜蘆醇含量沒有顯著差異（P>005）。染菌處理后，無論是葉片、葉柄還是莖段來源的愈傷組織中白藜蘆醇含量均顯著高于對照（葉片P=0007、葉柄P=0.001、莖段P=0.009）。這可能是由于雜菌污染可以作為一種脅迫，可以引發植物細胞產生防御性應答反應，誘導相關基因的表達，從而激活特定代謝途徑，促使葡萄離體細胞中白藜蘆醇的積累。已有研究表明，健康葡萄葉片中白藜蘆醇含量大大低于染病的葉片，感染的程度越大葉片中白藜蘆醇含量相對越高[10]。另外，文濤等發現真菌誘導可以提高虎杖愈傷組織中的白藜蘆醇含量[11]。本研究結果表明，染菌可以顯著提高愈傷組織生成白藜蘆醇的量，不同重復得到的結果差別偏大可能跟愈傷組織受到感染程度不同有關。

3結論

葡萄愈傷組織中白藜蘆醇的含量隨著AgNO3濃度的增加呈現先上升隨后又逐漸下降的趨勢，當其濃度為10 mg/L時，白藜蘆醇含量最高；而在濃度超過30 mg/L時，白藜蘆醇積累

受到抑制。葡萄愈傷組織中白藜蘆醇含量隨著紫外線照射時間的延長呈現先上升隨后又逐漸下降的趨勢。其中，光照 3 min 后莖段與葉片來源的愈傷組織白藜蘆醇含量最高，光照 5 min 后葉柄白藜蘆醇含量最高。但紫外光照超過 15 min，愈傷組織中的白藜蘆醇積累則會受到抑制。外植體的差異也會造成愈傷組織中白藜蘆醇含量不同，其中含量從高到低依次為葉片>莖段>葉柄，但無顯著差異。染菌處理可以顯著提高愈傷組織中白藜蘆醇的含量。

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