SD大鼠顱縫細胞不同時期GPC3基因表達變化的研究

張策　沈映勛　曹德君

·論著·

SD大鼠顱縫細胞不同時期GPC3基因表達變化的研究

張策沈映勛曹德君

【摘要】目的探索GPC3基因在顱縫組織和細胞中不同時期的表達情況，為后續的疾病模型研究提供參照。方法研究并觀察1 d、3 d、7 d的SD大鼠顱縫細胞組織，應用組織切片免疫熒光染色、RT-qPCR、Western Blot等方法，檢測其在不同年齡SD大鼠中的表達水平，判斷其與顱骨成骨及顱縫閉合的關系。結果免疫熒光顯示，GPC3在大鼠未閉合顱縫組織不同階段胞內、細胞表面及胞外均有表達；RT-qPCR、Western Blotting結果顯示，GPC3基因表達隨著大鼠年齡增長呈現下降趨勢。結論SD大鼠中，GPC3與顱縫閉合密切相關。

【關鍵詞】顱縫細胞SD大鼠磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3

約1/2 500的新生嬰幼兒中會出現一條或者多條顱縫提早閉合的現象，稱為顱縫早閉癥[1]，其發病率僅次于唇腭裂畸形。因為顱縫提前發生骨性閉合，會產生一系列臨床表現，如顱腔狹小、顱面骨畸形、顱內壓增高等，以及一些復雜的顱頜面畸形綜合征，如Crounzon綜合征、Apert綜合征等。嚴重者可引起腦發育受阻及智力發育障礙，嚴重影響患兒的正常發育、生理功能，甚至危及生命。目前，針對顱縫早閉癥的治療僅有手術一種方法，但風險高、費用高，且效果不理想。因此，亟需開展顱縫發育過程中調控機制與機理的研究，為探尋更好的治療方法奠定基礎。

顱縫早閉癥是一類由相關基因突變導致的疾病，其中約有20%已經確認了相關發病基因：FGFR2突變 （Apert、Crouzon和Pfeiffer綜合征），FGFR3突變 （Muenke綜合征），MSX2（Boston型綜合征），TWIST1（Saethre-Chotzen綜合征）等。Coussens等[2]發現，除 FGFR1～3等，還包括一系列與顱骨發育、顱縫閉合（成骨分化、轉錄、信號轉導、骨塑形、細胞周期、細胞凋亡）相關的新基因。研究表明，受累顱縫與正常顱縫相比，視黃醇結合蛋白-4（RBP4）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）、C1Q腫瘤壞死因子相關蛋白-3（C1QTNF3）均表達下調，其中GPC3下調7倍，提示GPC3基因在顱骨發育、顱縫閉合中可能存在調控作用。

GPC3，為蛋白聚糖（PGs）家族成員之一。蛋白聚糖作為細胞外基質主要成分之一，是一種大分子物質，可以結構性及功能性調節細胞的增殖、分化及基因表達。PGs由核心蛋白及一個或者多個葡糖氨基葡聚糖側鏈組成，可以分為硫酸肝素PGs（HSPGs）、硫酸皮膚素或軟骨素PGs（CSPGs）及硫酸角蛋白PGs。其中CSPGs大部分定位在細胞外基質中，而HSPGs常為膜性蛋白聚糖。HSPGs可以和許多配體發生直接作用，包括一些生長因子和成形素，如Wnts、BMPs、VEGFs等，以及相應的受體。HSPGs還可與細胞外結構及黏附性分子，如膠原蛋白、纖維蛋白及層黏連蛋白等發生作用。GPCs還可通過成對堿性氨基酸蛋白酶剪切位點的剪切，或GPI錨定作用的去除，進入到細胞外基質中，并發揮作用。GPC3就是一種膜性硫酸肝素蛋白聚糖，包含核心蛋白、硫酸乙酰肝素鏈 （HS）和糖基化磷脂酰肌醇（GPI），GPC蛋白通過GPI錨定于細胞外膜上。GPC3在哺乳動物的胚胎期，可通過影響多個信號通路而對組織器官的發生和生長發揮重要調控作用，目前的研究主要集中在基因與肝細胞癌的相關性[3]。

為明確GPC3在顱骨發育調控中的作用，以及突變后發生顱縫早閉癥的機制，本實驗以SD大鼠為模型，研究GPC3基因在顱縫組織和細胞中不同時期的表達情況，為后續的疾病模型研究提供參照。

1　材料與方法

1.1實驗動物及材料

出生1 d、3 d和7 d的SD大鼠，低糖DMEM （Hyclone，美國），胎牛血清（Biowest，法國），Ⅳ型膠原蛋白酶（SERVA，德國），胰蛋白酶-EDTA、Trizol液（Invitrogen，美國），M-MLV反轉錄酶及相關試劑（Promega，美國），大鼠 GPC3抗體（abcam，英國），EDTA（pH8.0）抗原修復液（武漢谷歌生物公司），氯仿，異丙醇等。

1.2主要儀器及設備

倒置相差顯微鏡（Leica公司，德國），光學顯微鏡（Olympus，日本），PCR儀（Eppendorf，德國），高速離心機 （Eppendorf，德國），凝膠成像分析儀（Syngene，英國），倒置熒光顯微鏡（NIKON ECLIPSE TISR，日本），成像系統（NIKON DS-U，日本）。

1.3方法

1.3.1免疫熒光

分別取出生1 d、3 d和7 d的SD大鼠，處死后置于75%乙醇溶液中浸泡10 min，無菌條件下切取顱蓋骨，剝離硬腦膜，取顱骨矢狀縫及冠狀縫周圍1.5 mm組織，盡量去除骨性組織后，加入4%多聚甲醛固定，脫水、透蠟、包埋、切片、脫蠟，制作石蠟切片。切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液（pH 8.0）的修復盒中，于微波爐內進行抗原修復。切片稍甩干后用3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min。輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加一抗，濕盒內4℃孵育過夜。PBS洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后，滴加二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50 min。PBS洗滌3次，每次5 min。甩干，滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min。PBS洗滌3次，每次5 min。甩干后用抗熒光淬滅，封片劑封片。倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3.2原代細胞獲取及培養

以上述相同方法，取顱骨矢狀縫及冠狀縫周圍1.5 mm組織，盡量去除骨性組織后剪碎，放入約10倍體積的0.2%Ⅳ型膠原蛋白酶中，37℃，5 h；100目濾網過濾，獲得細胞懸液，1 500 r/min離心3 min，棄上清液。10 mL完全培養液（DMEM+10FBS+ 1%雙抗）重懸細胞，轉移至培養皿中，37℃、5%CO2培養箱中培養。每3天換液一次，1周后胰蛋白酶消化，按1×104cells/cm2傳代接種。

1.3.3RT-qPCR

取傳種后第1代細胞，使用Trizol裂解，實驗操作參照Invitrogen Trizol使用說明，用紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度。將所得RNA逆轉錄形成cDNA模板，使用qPCR法定量分析，每個反應重復3次（表1）。

表1　引物序列Table 1　Primer Sequence

1.3.4Western-Blot

取部分原代細胞1 500 r/min離心后去上清液，加入細胞裂解液，4℃、12 000 g離心3 min，留取上清液后用Lowry法定量蛋白，完成電泳后，依次加入封閉液、抗rat GPC3抗體、二抗稀釋液，然后用化學發光劑反應后顯影定影。

1.4統計學分析

數據采用Graphpad Prism6軟件行單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1GPC3在不同年齡SD大鼠顱縫組織中的表達結果顯示，在1 d、3 d、7 d的顱縫組織中，胞內、

細胞表面及胞外均有GPC3表達，GPC3熒光的表達強度隨著大鼠年齡的增加逐步減弱（圖1）。2.2GPC3基因表達程度隨SD大鼠年齡的變化

圖1　不同年齡SD大鼠中GPC3的免疫熒光檢測（40×）Fig.1　Immunofluorescence of GPC3 in SD rat of different age (40×)

RT-qPCR結果顯示，隨著SD大鼠年齡增大，即隨著顱縫逐漸閉合，顱縫組織細胞中GPC3基因的表達水平明顯降低，其中1 d的SD大鼠顱縫細胞的GPC3基因表達量與3 d的SD大鼠細胞存在統計學差異 （P<0.05），3 d與7 d的SD大鼠細胞存在明顯差異（P<0.01）（圖2）。

圖2　RT-qPCR檢測不同年齡SD大鼠顱縫細胞GPC3的相對基因表達量Fig.2　The relative mRNA amount of GPC3 in SD rat of different age detected by RT-qPCR

Western Blot結果顯示，隨著SD大鼠年齡增大，即隨著顱縫逐漸閉合，GPC3在顱縫細胞中的表達量逐漸降低，其中3 d與7 d的SD大鼠的顱縫細胞存在統計學差異（P<0.05），但1 d與3 d的SD大鼠的顱縫細胞無統計學差異（圖3）。

圖3　Western Blot檢測不同年齡SD大鼠GPC3的表達Fig.3　The expression of GPC3 in SD rat of different age detected by Western Blot

3　討論

本研究中，我們首先應用免疫熒光技術來確定GPC3基因在大鼠顱縫組織中的表達位置。通過熒光圖像發現，GPC3基因在1 d、3 d、7 d的SD大鼠顱縫組織中均有表達，且在胞內、細胞表面及細胞外基質中均檢測到GPC3，說明GPC3的生理作用可能不僅限于錨定在細胞表面，解錨定后，GPC3進入細胞外基質中可能也會發揮相應的作用，具體機制仍有待探索。

我們應用RT-qPCR和Western Blot技術分別從轉錄水平和蛋白水平，來確定GPC3隨著SD大鼠年齡增加的表達情況。RT-qPCR結果顯示，隨著SD大鼠年齡增加，GPC3基因的表達量明顯下降，且第3天到第7天的下降程度明顯較第1天到第3天的程度大，這與SD大鼠的顱縫閉合趨勢是相符合的。Western Blot的結果也從蛋白水平上基本驗證了這個結果。因此，我們判斷，GPC3基因的表達與顱縫閉合存在非常緊密的聯系，該基因在顱縫成骨的過程中可能扮演了非常重要的角色。

GPCs（磷脂酰肌醇蛋白聚糖類）為HSPGs家族成員之一，是一種生長因子通路的調節因子，一般通過糖基化磷酯酰肌醇錨定于細胞膜。解開錨定，脫離細胞膜后，即成為游離態的GPCs，同樣也會產生一定的生理功能。其在細胞的主要信號通路，如BMP信號通路、FGF信號通路、HH信號通路以及WNT信號通路中，都有其特定的效應。因此，該類蛋白在生長發育和穩態調節中均有重要的作用[4]。

Pilla等[5]報道了GPC3基因突變所導致的X連鎖遺傳病：過度生長和畸變綜合征（SGBS）。Cano-Gauci等[6]發現，敲除小鼠GPC3基因的第一個外顯子后，其體內無法檢測到GPC3基因的mRNA的表達，并出現典型的SGBS的臨床表現，包括圍產期死亡、過度生長發育、多囊腎、腎發育不全及肺部異常發育等。

GPC3在細胞信號轉導過程中有著重要的作用，目前的研究對于其與BMP信號通路的關系研究比較明確。骨形成蛋白（BMPs）是促進骨形成的重要蛋白。BMPs信號通道中的效應器轉錄因子MSX2，發生基因突變可導致Boston-type顱縫早閉。兔動物模型研究顯示，高濃度的BMP2可導致顱縫過早閉合[7]。因此，BMPs及其信號通道是明確顱縫早閉發病機制的重要研究方向之一。文獻提示，GPC3參與調節骨形成蛋白（BMPs）及其信號通道。Dwivedi等[8]發現，GPC3在顱縫區表達，而在顱縫過早閉合的患兒顱縫區表達是下降的。此外，GPC1和GPC3同時表達于顱縫細胞表面并釋放入細胞外基質。同時表達的GPC1與GPC3可抑制BMP2、BMP4和BMP7的活性，消除GPC1和GPC3活性可增強BMP2活性。相反，使GPC1和GPC3過表達或者在培養體系中添加GPC1或GPC3，可阻止BMP2信號通道及BMP2調節的成骨分化。該結果表明，GPC3對BMPs信號通道具有負向調節作用。而Dejima等[9]的研究則表明，GPCs對BMPs信號通道具有正向調節作用。無論是體內還是體外實驗均顯示，果蠅的GPCs可增強BMPs信號通道。這兩種矛盾的結果可能是由于物種的不同所導致的，但都表明了GPCs參與BMPs信號通道的調節。另外，通過對GPC3基因敲除小鼠的研究發現，GPC3與BMP4在骨發育中具有相互作用[10]，與BMP2、BMP7在腎形態發育中具有相互作用類似[11-12]。關于GPC3在FGF、WNT信號通路中的作用，目前僅有少量研究。Midorikawa等[13]發現，GPC3在肝癌細胞中，與FGF2相互作用，并抑制FGF信號通路；Lai等[14]發現，GPC3在肝癌細胞中增強經典WNT信號通路并促進肝癌細胞生長。但是，對于小鼠乳腺腺癌細胞的研究發現，GPC3抑制經典WNT信號通路，增強非經典WNT信號通路[15]。因此，GPC3在FGF信號通路和WNT信號通路中的作用機制仍然需要進一步的探索研究。

本實驗初步闡明了GPC3基因在SD大鼠顱縫發育過程中的表達趨勢，結合Coussens等的研究結果，我們推斷，GPC3的低表達可能與顱縫早閉的發生與發展存在密切的聯系，對于其在顱縫早閉癥中的具體作用與機制仍然需要進一步的實驗探索。

參考文獻

[1]Wilkie AOM.Craniosynostosis:genes and mechanisms[J].Hum Mol Genet,1997,10(6):1647-1656.

[2]Coussens AK,Wilkinson CR,Hughes IP,et al.Unravelling the molecular control of calvarial suture fusion in children with craniosynostosis[J].BMC Genomics,2007,8:458.

[3]Song HH,Shi W,Xiang YY,et al.The loss of glypican-3 induces alterations in Wnt signaling[J].J Biol Chem.2005,280(3): 2116-2125.

[4]Svensson G,Awad W,Hakansson M,et al.Crystal structure of N-glycosylated human glypican-1 core protein:structure of two loops evolutionarily conserved in vertebrate glypican-1[J].J Biol Chem,2012,287(17):14040-14051.

[5]Pilia G,Hughes-Benzie RM,Mackenzie A,et al.Mutations in GPC3,a glypican gene,cause the Simpson-Golabi-Behmel overgrowth syndrome[J].Nat Genet,1996,12(3):241-247.

[6]Cano-Gauci DF,Song HH,Yang H,et al.Glypican-3-deficient miceexhibitdevelopmentalovergrowthandsomeofthe abnormalities typical of Simpson-Golabi-Behmel syndrome[J].J Cell Biol,1999,146(1):255-264.

[7]Kinsella CJ,Cray JJ,Durham EL,et al.Recombinant human bone morphogenetic protein-2-induced craniosynostosis and growth restriction in the immature skeleton[J].Plast Reconstr Surg,2011,127(3):1173-1181.

[8]Dwivedi PP,Grose RH,Filmus J,et al.Regulation of bone morphogenetic protein signalling and cranial osteogenesis by Gpc1 and GPC3[J].Bone,2013,55(2):367-376.

[9]Dejima K,Kanai MI,Akiyama T,et al.Novel contact-dependent bonemorphogeneticprotein(BMP)signalingmediatedby heparan sulfate proteoglycans[J].J Biol Chem,2011,286(19): 17103-17111.

[10]Paine-Saunders S,Viviano BL,Zupicich J,et al.Glypican-3 controls cellular responses to Bmp4 in limb patterning and skeletal development[J].Dev Biol,2000,225(1):179-187.

[11]Grisaru S,Cano-Gauci D,Tee J,et al.Glypican-3 modulates BMP-and FGF-mediated effects during renal branching morphogenesis[J].Dev Biol,2001,231(1):31-46.

[12]Hartwig S,Hu MC,Cella C,et al.Glypican-3 modulates inhibitory Bmp2-Smad signaling to control renal development in vivo[J]. Mech Dev,2005,122(7-8):928-938.

[13]Midorikawa Y,Ishikawa S,Iwanari H,et al.Glypican-3,overexpressed in hepatocellular carcinoma,modulates FGF2 and BMP-7 signaling[J].Int J Cancer,2003,103(4):455-465.

[14]Lai JP,Oseini AM,Moser CD,et al.The oncogenic effect of sulfatase 2 in human hepatocellular carcinoma is mediated in part by glypican 3-dependent Wnt activation[J].Hepatology, 2010,52(5):1680-1689.

[15]Stigliano I,Puricelli L,Filmus J,et al.Glypican-3 regulates migration,adhesionandactincytoskeletonorganizationin mammary tumor cells through Wnt signaling modulation[J]. Breast Cancer Res Treat,2009,114(2):251-262.

【中圖分類號】R622

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673－0364（2016）03－0163－04

doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2016.03.005

作者單位：200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院整復外科。

通訊作者：曹德君（E-mail：dejuncao@163.com）。

收稿日期：（2016年4月15日；修回日期：2016年6月8日）

Expression of GPC3 in Cranial Suture Cells of Different Stages of Rats

ZHANG Ce,Shim Yoong-hoon,CAO Dejun. Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:CAO Dejun(E-mail:dejuncao@163.com).

【Abstract】ObjectiveTo explore GPC3 expression in cranial suture tissues and cells of different stages,and to provide reference for later research in disease models.MethodsThe cranial suture tissues and cells of 1 d,3 d,7 d SD rats were observed.The expression level of GPC3 were analyzed by immune-histofluorescence staining,RT-qPCR and Western Blot to judge the relationship between GPC3 expression and calvarial osteogenesis/fusion of cranial sutures.ResultsGPC3 was expressed in all stages of unfused rat cranial suture tissues by immune-histofluorescence staining.Results of RT-qPCR and Western Blot showed a descending trend of GPC3 expression with the age increasing.ConclusionIn SD rats,GPC3 has a close relationship with fusion of cranial sutures.

【Key words】Cranial suture cells;SD rats;GPC3