SSR標記在糯玉米品種鑒定上的應用

張振良++郝德榮++陳國清++陸虎華+石明亮+冒宇翔++吳嘉點+黃小蘭+程玉靜+周廣飛++薛林

摘要：采用NY/T 1432—2014《玉米品種鑒定技術規程SSR標記法》中的20對簡單重復序列（SSR）引物對市場上抽檢的蘇玉糯11、蘇玉糯901、蘇玉糯13、蘇玉糯14、蘇玉糯639等5個糯玉米品種進行真實性鑒定。結果表明，每個抽檢品種與標準品種至少有6個差異位點，這5個品種均與相應的標準品種不同；此外，umc1545y2、umc1335y5、umc2105k3、umc1705w1、umc1125y3、umc2007y4、phi053k2、bnlg2305k4等8對引物多態性較好，在今后糯玉米品種鑒定中可優先采用。

關鍵詞：糯玉米；SSR標記；品種；鑒定；應用

中圖分類號： S513.03文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0104-02

收稿日期：2015-05-15

作者簡介：張振良（1987—），男，山東東平人，碩士，研究實習員，研究方向為玉米分子遺傳和育種。E-mail：zhenliang1110@163.com。

通信作者：薛林，研究員，研究方向為玉米育種。E-mail：417803648@qq.com。糯玉米因其營養豐富、風味獨特、適口，越來越受到廣大消費者歡迎。糯玉米種植面積越來越大，品種數量逐年上升，品種真實性鑒定需求也急劇增加。糯玉米育種中由于少數骨干親本的集中應用，造成品種間遺傳基礎狹窄，僅從形態上鑒定存在一定困難，給玉米品種的生產、經營、使用以及種子管理部門的監督帶來一定挑戰。隨著DNA指紋圖譜技術的發展，以簡單重復序列（SSR）為代表的分子標記技術逐漸成熟并應用于農業種子生產研究和種子質量管理[1-2]。2014年，中國農業部公布了一系列主要農作物品種鑒定的行業標準，如NY/T 1432—2014《玉米品種鑒定技術規程SSR標記法》、NY/T 1433—2014《水稻品種鑒定技術規程SSR標記法》，代替了2007年公布的行業標準，使SSR標記技術對農作物品種真實性鑒定的方法更加完善和準確。為進一步明確SSR標記在糯玉米品種真實性鑒定中的作用，本研究采用NY/T 1432—2014《玉米品種鑒定技術規程SSR標記法》標準鑒定5個疑似套牌糯玉米雜交種的真實性，同時探討SSR分子標記技術在糯玉米品種真實性鑒定中的應用前景。

1材料與方法

1.1材料

市場上抽檢的蘇玉糯11、蘇玉糯901、蘇玉糯13、蘇玉糯14、蘇玉糯639等5個糯玉米品種，疑是套牌種子依次編號為A、B、C、D、E，標準品種分別編號為A1、B1、C1、D1、E1。其中套牌種子由種子管理部門提供，標準品種由江蘇沿江地區農業科學研究所玉米室提供。分別對每個樣品（品種）的5個個體單獨進行分析。

1.2DNA提取

取約0.2 g玉米幼嫩葉片于液氮中研磨，轉入2 mL離心管中，加入800 μL預熱65 ℃的CTAB提取緩沖液，混勻，水浴60 min，每隔10 min小心搖動離心管；取出離心管，待冷卻至25 ℃，加入800 μL三氯甲烷 ∶ 異戊醇（24 ∶ 1），小心充分搖動試管至有機相呈深綠色，室溫下于8 000 r/min離心 10 min；用剪口的1 mL槍頭將上清液轉移到另一離心管中，加入2/3體積預冷的異丙醇（-20 ℃），小心混勻；8 000 r/min 離心 2 min，棄上清液，用5 00 μL 70%乙醇清洗2次，棄上清液，干燥沉淀，加150 μL TE溶解。

1.3PCR擴增

根據NY/T 1432—2014《玉米品種鑒定技術規程SSR標記法》標準，選用bnlg439w1、umc1335y5、umc2007y4、bnlg1940k7、umc2105k3、phi053k2、phi072k4、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg2305k4、bnlg161k8、bnlg1702k1、umc1545y2、umc1125y3、bnlg240k1、phi080k15、phi065k9、umc1492y13、umc1432y6、umc1506k12等20對SSR標記，均勻分布在玉米10對染色體上。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系（10 μL）為：1 μL 模板DNA （100～150 ng），上、下游引物（10 μmol/L）各0.2 μL、1 μL 10×Taq buffer、0.7 μL MgCl2、0.8 μL dNTP（2.5 mmol/L）、DNA Polymerase（2.5 U/μL）0.2 μL（TIANGEN），其余以超純水補足至所需體積。反應液上加蓋15 μL石蠟油，以防反應過程中水分蒸發。PCR程序為： 94 ℃，5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共31個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃恒溫冷藏。

1.4非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及顯色。

PCR產物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色。

1.5品種真實性鑒定標準

從樣品中隨機抽取5個單株作為檢測樣本。根據抽檢樣本電泳譜帶和標準品種電泳譜帶的一致性鑒定品種的真實性。結果按照農業部頒布的行業標準NY/T 1432—2014《玉米品種鑒定技術規程SSR標記法》判定。當樣品間差異位點數≥2，判定為不同；當樣品間差異位點數=1，判定為近似；當樣品間差異位點數=0，判定為極近似或相同。

2結果與分析

2.1糯玉米雜交種DNA檢測

對提取的糯玉米基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果見圖1。結果表明，提取的玉米基因組DNA主帶清晰一致，適合進一步的SSR分析。

2.2品種內遺傳一致性分析

20對引物中有umc1125y3、bnlg161k8、umc1506k12等3對引物在品種內發生變異，均發生在抽檢的蘇玉糯13、蘇玉糯14、蘇玉糯639中，且都屬于在5個單株檢測重復中只發現1個不一致的情況（圖2）。20對引物對10個糯玉米雜交種的200次擴增中，出現了共計5次品種內變異，占2.5%，說明品種內變異較小，電泳譜帶比較結果是可靠的。

2.3糯玉米SSR鑒定分析

對抽檢的5個糯玉米雜交種和標準品種電泳譜帶比較可知，抽檢的蘇玉糯11與標準品種相比有11個差異位點，占引物總數的55%；蘇玉糯901與標準品種相比有7個差異位點，占引物總數的35%；蘇玉糯13與標準品種相比有6個差異位點，占引物總數的30%；蘇玉糯14與標準品種相比有9個差異位點，占引物總數的45%；蘇玉糯901與標準品種有6個差異位點，占引物總數的30%（表1）。按照農業部頒布的行業標準NY/T 1432—2014《玉米品種鑒定技術規程 SSR標記法》，可判定待檢測的5個抽檢樣品與相應的標準品種為不同品種。

2.4引物多態性分析

umc1545y2在5個品種鑒定中均為差異位點（圖3），umc1335y5、umc2105k3、umc1705w1、umc1125y3在4個品種中均檢測到差異位點，umc2007y4、phi053k2、bnlg2305k4、bnlg1702k1 在3個品種中均檢測到差異位點（表1）。上述差異位點均在多個抽檢品種與標準品種間檢測到，說明這些位點多態性較高。

3結論與討論

SSR分子標記為共顯性遺傳，反映的是具體DNA片段的大小，既不受組織器官及發育階段的影響，也不受季節和環境因素的制約，與傳統田間種植鑒定相比，是一種更加快速、準確鑒定品種真實性的方法，廣泛應用于種質資源分析和農作物品種鑒定[3-7]。本研究采用SSR標記對市場上抽檢的5份糯玉米品種進行鑒定，結果表明，抽檢的5個糯玉米品種均與相應的標準品種不同，與田間鑒定結果一致，說明SSR標記鑒定結果可靠準確。

引物篩選是SSR標記鑒定品種真實性的關鍵，選用多態性高、染色體上分布均勻、穩定性好的引物可有效提高工作效率、降低成本[7-8]。本研究采用農業部公布的NY/T 1432—2014《玉米品種鑒定技術規程SSR標記法》中的前20對引物，這20個SSR位點的帶型清晰、穩定性較好，平均分布在玉米的10條染色體上，其中有9對引物在至少3個糯玉米品種中檢測出差異位點，說明這9對引物在糯玉米品種中多態性較好，在今后糯玉米品種鑒定中可優先采用，以減少工作量、降低成本。

由于剩余遺傳效應作用，品種內變異普遍存在，品種內變異導致品種內不同個體之間重復帶型不一致，在品種真實性鑒定中會干擾判斷[3]。為避免糯玉米品種內產生遺傳變異造成的誤差，本研究對每份糯玉米雜交種均采用5個單株重復。結果表明，20對引物只有3對引物發生品種內變異，且5個單株檢測重復中只發現1個不一致情況，屬于可控范圍內。針對品種內重復性差的樣品，則需要擴大檢測樣品的重復次數。

品種真實性鑒定作為種子生產和種子檢驗的重要環節，應得到種子管理部門的高度重視。SSR標記因其多態性高、重復性強的特點已被農業部確定為品種真實性鑒定的有效方法。SSR分子標記技術在種子管理工作中應充分發揮作用，一方面應用于市場糯玉米種子質量監督抽查，以阻止套牌侵權品種上市流通，保障農民合法權益；另一方面應用于糯玉米品種審定區域試驗，以維護區試工作中的公正、公平，維護育種單位以及廣大種子生產者的利益。

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