利用正交試驗法優化團花不定芽分化培養基

黃浩++蒙愛東

摘要：為了獲得團花不定芽分化的最佳激素組合和外植體類型，以團花20～30 d無菌苗的子葉、下胚軸和真葉為外植體材料，采用L9（34）正交試驗表，2，4-D、2-iP、6-BA為正交試驗的3因素，進行直接誘導不定芽分化試驗。結果表明，以真葉為外植體，不定芽分化率最高，為73.3%，激素組合為MS+0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 2-iP+1.5 mg/L 6-BA；下胚軸的不定芽分化率次之，最高為66.6%；子葉的不定芽分化率最低，最高值僅為40.0%。試驗結果可為工廠化生產優良團花種苗，并可為團花遺傳轉化研究奠定基礎。

關鍵詞：團花；組織培養；正交試驗；不定芽

中圖分類號： Q813.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0078-03

收稿日期：2015-05-18

基金項目：廣西醫療衛生重點科研課題（編號：重200907）。

作者簡介：黃浩（1972—），男，廣西柳州人，助理研究員，主要從事藥用植物育種和栽培研究。E-mail：hmouse@163.com。

通信作者：蒙愛東，教授，從事藥用植物育種和組織培養。E-mail：mengaidong@126.com。團花[Neolamarckia cadamba（Roxb.）Bosser]為茜草科（Rubiaceae）團花屬（Neolamarckia Bosser）植物，為亞洲熱帶十分罕見的闊葉速生樹種。由于團花生長迅速，樹干通直，因而被譽為“奇跡樹”，早在20世紀70年代就受國內外普遍關注。其木材淡黃色，紋理通直，不易開裂和變形，是較好的家具、建筑裝飾等用材。早在印度古醫“阿優吠陀”經中，就有用樹皮治療疾病的記載；樹皮含有豐富的生物堿類，其中 3α-二氫卡丹賓和3β-二氫卡丹賓為治療高血壓藥物“鉤藤總堿”的有效成分，具有強而持久的降壓作用，其效價已經接近利血平[1]。樹葉含較高蛋白質，可作動物飼料；花是良好的蜜源。因用途廣泛而具有較高開發價值和較大應用前景[2-4]。

團花在中國僅有1種[5]，主要分布于廣東、廣西、云南海拔50～1 100 m的山谷溪旁或雜木林下；在云南省海拔 1 080 m 以下的亞熱帶地區有集中分布[5-6]，喜溫不耐寒。國內外學者主要開展團花的樹皮藥用成分[1，7-11]、引種和栽培[12-18]生物技術[19-21]研究，并取得較好的進展。盡管利用大田苗頂芽或側芽通過以芽繁芽的組織培養方式[22-23]進行團花植株再生研究已獲得一定的成效，由于僅作為繁殖優良植株的目的，無法利用該不再生體系進行進一步的分子試驗如遺傳轉化研究。本試驗擬利用正交試驗設計，通過器官直接分化方式對團花3種不同外植體進行不定芽誘導研究，以期優化出較好的外植體和激素組合。本試驗不僅可快速獲得大量健壯不定芽，也可為團花遺傳轉化特別是轉抗寒或其他抗性基因的研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料和試劑

成熟、飽滿的團花種子，采自廣西藥用植物園本草綱目園。經洗凈晾干后于低溫種子柜保存。

NaClO溶液500 mL塑料瓶包裝，天津市津宇精細化工有限公司生產；滅菌工作溶液配制：將50 mL NaClO原液加入到950 mL無菌水中搖勻；2，4-D、2-iP、6-BA、瓊脂、蔗糖購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.2方法

1.2.1浸種和無菌幼苗的獲得用小袋包好種子，放入裝有約100 mL無菌水的250 mL玻璃組培瓶中，在37 ℃恒溫振蕩箱振蕩浸泡24 h。在無菌超凈臺上，將包著種子的小袋浸于NaClO工作溶液中滅菌15 min，再用無菌水徹底沖洗5次，最后將種子播于不含任何激素的MS培養基中（培養室溫度為（25±2）℃，誘導不定芽分化時前30 d采用暗培養，之后進行光培養（光周期為14 h），人工光照強度2 000 lx。）20～30 d后，即可得到含1對子葉和第1對真葉、高度為5～10 mm的無菌苗。

1.2.2外植體的獲得外植體分別為無菌苗子葉、真葉、下胚軸。在無菌超凈臺中，子葉、真葉（均含葉柄）可用鑷子從上述無菌幼苗小心剝下，不含子葉節的下胚軸直接用解剖刀切取。每種外植體均按L9（34）正交試驗表進行單獨的正交試驗。

1.2.3試驗設計正交試驗設計采用L9（34）正交表，將培養基中的3個激素2，4-D、2-iP、6-BA設為正交試驗的3因素，每因素設3水平，為避免在試驗過程中人為因素導致的系統誤差，因素水平數（激素濃度）在試驗表中不完全按數值大小遞增或遞減順序排列，而按隨機化方法排列，空列作為方差分析的誤差列[24]。試驗因素和水平見表1，試驗結果見表 2。

1.2.4培養基培養基均以MS作為基本培養基，添加瓊脂6 g/L，蔗糖30 g/L，添加激素后調整pH值內5.8，然后在 0.1 MPa、121 ℃高溫滅菌20 min，自然冷卻凝固，放置1 d后使用。

1.3統計與數據處理

外植體接種后40 d，統計不定芽分化率，同時觀察不定芽的生長情況。采用直觀分析和方差分析法對數據進行分析。每種外植體重復3次，每次15個外植體，分化率為3次重復的平均值。

不定芽分化率=（長出不定芽的外植體個數/外植體總數）×100%。

數據處理和作圖用Excel 2007完成。

2結果與分析

2.1不定芽分化率和直觀分析

不同外植體的不定芽分化率結果見表 2。從極差項的結果可看出，在3個不同的外植體中，生長素2，4-D極差項均為最大值，表明2，4-D對3個外植體的不定芽分化影響最大。影響子葉直接分化不定芽的主次因素依次為2，4-D、2-iP（或6-BA）、6-BA（或2-iP），最優激素組合為0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 2-iP+1.5 mg/L 6-BA，與試驗號4吻合，子葉的不定芽分化率最高達40%。影響下胚軸直接分化不定芽的主次因素依次為2，4-D、2-iP、6-BA，最優激素組合為0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 2-iP+2.0 mg/L 6-BA，與試驗號1吻合，下胚軸的不定芽分化率最高達40%。影響真葉直接分化不定芽的主次因素依次為2，4-D、6-BA、2-iP，最優激素組合應為0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 2-iP+1.5 mg/L 6-BA，沒有試驗號與其吻合。

2.2不同激素誘導不定芽分化率比較

2.2.1不同激素誘導子葉不定芽分化率不同激素誘導子葉不定芽分化率見圖1。隨著2，4-D、2-iP、6-BA濃度升高，子葉誘導不定芽分化率均出現先增大后下降的趨勢，當2，4-D濃度為0.5 mg/L，2-iP濃度為0.5 mg/L，6-BA濃度為1.5 mg/L時，不定芽分化的效果最佳。

2.2.2不同激素誘導下胚軸不定芽分化率不同激素誘導下胚軸不定芽分化率見圖2，隨著2，4-D、2-iP、6-BA濃度升高，下胚軸誘導不定芽分化率變化較大。當2，4-D濃度為0 mg/L，2-iP濃度為0.5 mg/L，6-BA濃度為2.0 mg/L時，不定芽分化效果最佳。此外，不定芽分化率有隨6-BA濃度升高而提高的趨勢，適當提高6-BA的濃度，有可能會得到更優的誘導不定芽分化組合。

2.2.3不同激素引導真葉不定芽分化率不同激素引導真葉不定芽分化率見圖3，當2，4-D濃度為0.5 mg/L，2-iP濃度為1.0 mg/L，6-BA濃度為1.5 mg/L時，不定芽分化的效果最佳。不定芽分化率有隨2-iP濃度升高而提高的趨勢，

適當再提高2-iP的濃度，有可能會得到真葉誘導不定芽分化的更優方案。與下胚軸誘導不定芽分化率隨6-BA濃度的升高而提高的趨勢不同。

2.3方差分析

方差分析結果見表3。

從表3看出，除了2，4-D對子葉誘導不定芽分化具有顯著影響外，2，4-D對其他2個外植體的不定芽誘導無顯著影響；2-iP、6-BA對3種外植體不定芽誘導均無顯著影響。

3討論與結論

從試驗的總體結果來看，子葉誘導不定芽分化率較低；從試驗號1到試驗號6，下胚軸誘導分化率最低為33%，最高為66.7%，誘導分化的總體狀況較好；而真葉除了在試驗號4和試驗號6的誘導分化率較高外，其余試驗均低于30%。另外，無論是從子葉、下胚軸還是真葉誘導分化出來的不定芽，生長均較健壯，生長狀況無明顯差異（圖4）。

不同外植體的最佳不定芽分化率并不出現在同一個激素組合（即同一個試驗號），可能是不同外植體組織（或細胞）在相同生長時期具不同生長特性，導致對相同激素組合的響應不同。

當2，4-D濃度為 0 mg/L 時，下胚軸的不定芽分化率較好；當2，4-D濃度為0.5 mg/L時，子葉和真葉的不定芽分化率較好；當2，4-D濃度為1.5 mg/L時，不論2-iP、6-BA濃度如何變化，3個不同外植體不定芽分化的誘導率均很低，可能是高濃度2，4-D對這些幼嫩的外植體產生一定的傷害，導致組織或細胞較難直接分化甚至死亡；而2-iP、6-BA對不定芽分化率影響不如2，4-D的變化顯著。

在誘導真葉直接分化試驗中，從直觀分析和趨勢中均可看出，最好的激素組合應為0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 2-iP+1.5 mg/L 6-BA，理論上應比試驗號6的分化率（即最大值73.3%）高，但此激素組合并不在本試驗的激素組合中。在下一步試驗中可對主要因素（主要是2，4-D）的水平作適當調整，選取更優水平，以期獲得更高的誘導分化率。

本試驗研究結果表明，為獲得質量較好的不定芽，可用MS+0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 2-iP+2.0 mg/L 6-BA作為下胚軸的誘導培養基；或用MS+0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 2-iP+1.5 mg/L 6-BA作為真葉的誘導培養基。這2種方法均可通過直接分化的方式獲得健壯的不定芽，避免通過愈傷組組再分化的途徑獲取再生芽而產生的變異苗的可能；在獲得不定芽后，按鄧小梅等的方法[22-23]選取健壯的芽，進行擴繁、生根和移栽，即可獲得再生小苗。移栽1年后，經與初生種子苗對比，在生長性狀上無明顯差異。通過直接分化獲得不定芽，在很大程度上減少了培養周期、人力和物力，也為進一步進行團花遺傳轉化研究奠定基礎。

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