桃PG基因家族的鑒定與分析

霍如雪 劉振寧 楊青 +王光全

摘要：多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）屬于一個大的水解酶家族，它通過降解果膠在植株生長發育過程中的細胞分離事件中發揮重要作用。為深入研究桃PG基因家族的功能，利用生物信息學方法對桃基因組中PG基因家族成員進行鑒定，對其基因和蛋白特征、保守結構域、基因進化樹分類和基因表達模式等方面進行研究。結果表明，在桃基因組中共鑒定出了84個PG基因，可以聚類成7個分支A～G；PG基因在8條染色體上呈現不均勻分布，并存在明顯的串聯重復現象，共發現16個串聯重復基因簇；利用 UniGene 數據庫進行的組織表達分析。說明有 10 個基因在數據庫中有表達數據，其中有6個基因具有組織表達特異性。

關鍵詞：桃；多聚半乳糖醛酸酶；基因家族；生物信息學

中圖分類號： S662.103文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）06-0033-08

多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）是一種細胞壁結合蛋白，具有水解酶性質，廣泛存在于細菌、真菌和植物中。PG大約在52年以前被鑒定，并被證明參與到植株生長發育各個時期中果膠的降解。在降解果膠的諸多酶類中，PG屬于其中最大的水解酶家族。目前，已經在擬南芥、水稻、楊樹、白菜、黃瓜、甜瓜、卷柏、小立碗蘚等物種中對其基因家族進行了鑒定，并在進化上進行了分析[1-8]。PG從性質上主要分成3種，即內切PG、外切PG、鼠李糖PG。根據不同的分類標準，不同研究者將PG聚類為不同的亞類。擬南芥A～F等6類中的PG基因在表達模式上存在差異，有些亞類的成員趨向于在營養組織中表達，而有些則趨向于在生殖器官中表達[8]。不同亞類的PG可能具有獨特的生物學功能。Park 等認為，A類和B類含有陸生植物的PG基因，E類含有從藻類到開花植物的PG基因，而C、D、F類則只含有開花植物的PG基因[8]。對水稻、楊樹、苔蘚、小立碗蘚和擬南芥5個物種中的225個PG的研究表明，A類和B類為內切PG，C類和D類為外切PG，E類為鼠李糖PG，而F類的成員不能被歸類于不同性質PG中的任何一種[6]。

根據Hadfield等對植物PG功能的分類，PG可以分為三大類，與果實成熟相關的PG、與器官脫落相關的PG、與花粉發育相關的PG[9]。研究表明，cpPG1和木瓜果肉軟化有關，cpPG1在木瓜中的過表達能夠促進果肉的軟化[10]。Roongsattham等在油棕果實成熟和脫落的過程中鑒定出14個PG基因，這些基因均在果實成熟時基部的脫落區表達[11]。RDPG1是油菜中的一個PG基因，主要在果莢和花藥的開裂區表達，并且在花器官的脫落區、花粉管生長過程中的花柱組織、莖和花梗的節點中表達，表明RDPG1可能與器官脫落有關[12]。在擬南芥花粉發育過程中，花粉母細胞減數分裂形成四分體小孢子，研究發現，PG基因[WTBX][STBX]QRT3[WTBZ][STBZ]參與了四分體小孢子的分離。在花粉發育的早期，[WTBX][STBX]QRT3[WTBZ][STBZ]由絨氈層分泌降解四分體小孢子周圍的花粉母細胞壁，從而使得四個小孢子能夠正常分離[13]。

桃（Prunus persica）是薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）植物，是世界上廣泛栽培的落葉果樹之一[14]。與薔薇科木本植物如李和酸櫻桃等多倍體果樹相比，桃是二倍體（n=8 ），具有相對較小的基因組（230 Mbp），而且具有相對短的童期（2～3年），這些獨特的優點使得桃成為李屬及其他薔薇科植物的模式基因組物種[15]。桃基因組測序的完成和序列釋放[16]使得在全基因組水平上對桃的重要功能基因的發掘比較和功能研究成為可能。本研究利用生物信息學方法對桃PG基因家族成員進行了鑒定和基因組注釋，分析了其基因結構和保守域，以期為進一步對桃PG家族基因的功能研究提供基礎信息并最終在分子水平上對桃品種的改良提供明確的候選基因。

1材料與方法

1.1桃PG基因家族的鑒定

首先，利用擬南芥PG蛋白的氨基酸序列作為種子序列在桃基因組數據庫（http：//www.rosaceae.org/species/prunus_persica/genome_ version 2.0）[16]中BlastP比對搜索。其次，為保證候選基因沒有被遺漏，又利用搜索到的PG蛋白的氨基酸序列對桃基因組數據庫進行2次BLASTP比對搜索。最后，利用Pfam數據庫（http：//pfam.janelia.org/）、SMART數據庫（http：//smart.embl-heidelberg.de/）和NCBI的保守域數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析候選蛋白的結構域，根據候選蛋白的氨基酸序列是否至少具有一個PG的保守結構域（SPNTDGI、GDDC、CGPGHGISIGSLG和RIK）進行候選PG基因的篩選和鑒定。除上述方法獲得的PG基因外，還包括[WTBX][STBX]At4g20050（QRT3[WTBZ][STBZ]）[13]，該基因雖然不含有PG基因的任何一個結構域，但是它已經被證明為PG基因。因此，[WTBX][STBX]At4g20050[WTBZ][STBZ]基因在桃基因組中的同源基因單獨用BLASTP搜索獲得。

1.2桃PG基因的基因組信息和染色體定位

桃PG基因的序列和基因組信息通過桃基因組數據庫獲得，并根據每一個PG基因在染色體上的精確位置和染色體的長度使用Photoshop軟件將PG基因人工定位到對應的染色體上。

1.3桃PG蛋白的生理生化分析

PG蛋白的分子量和等電點通過（Compute pI/Mwsoftware （http：//www.expasy.ch/tools/pi_tool.html）[17]來預測，信號肽序列通過SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）[18]分析。

[BT2+*5]1.4桃PG基因的結構分析、保守域分析和進化樹分析

GSDS網站（http：//gsds1.cbi.pku.edu.cn/）[19]用來分析PG基因的外顯子-內含子結構。在線的MEME軟件（http：//meme.sdsc.edu/meme/meme.html）[20]用來鑒定PG蛋白的氨基酸序列中的基序。Clustal X軟件用來對PG蛋白的氨基酸序列進行比對。對進化樹的構建，首先利用MEGA 50軟件（http：//www.megasoftware.net/）自帶的Clustal W應用對蛋白的氨基酸序列進行比對分析，空格罰分設置為10，空格擴展罰分設置為0.2。然后將比對好的序列利用MEGA 50軟件構建進化樹，進化樹使用鄰接法構建，采用泊松校正，成對刪除和1 000次重復等建樹參數[21]。

1.5桃PG基因的表達

在NCBI數據庫中對每個桃PG基因進行BLASTN比對搜索，取高相似度的序列（>95%）搜索其Unigene的EST表達數據，并將基因的表達數據轉換成Log2的格式，最終的基因表達數據使用Multiple Array Viewer軟件[22]以熱點圖的形勢呈現。

2結果與分析

2.1桃PG基因家族的鑒定和注釋

根據擬南芥PG蛋白的氨基酸序列，通過對桃基因組數據庫的BLAST搜索，在桃基因組中共鑒定出了84個PG基因，并參考擬南芥PG基因的命名方法[4]對桃PG基因進行命名（表1）。這84個PG基因的開放閱讀框長度在426～2 127 bp，編碼141～708個氨基酸，相應的蛋白分子量在1576～7463 ku，等電點在4.48～9.52之間。對PG蛋白信號肽的預測表明，其中64個蛋白具有一段N末端信號肽，信號肽長度為15～32個氨基酸。對桃PG基因染色體定位（圖1），研究表明，PG基因在桃的8條染色體上呈現不均勻分布，其中第1、第2、第3、第4、第7染色體上具有比較多的PG基因，而第5、第6、第8染色體上的PG基因比較少。此外，PG基因在染色體上分布存在明顯的串聯重復現象，共發現了16個串聯重復基因簇，共包含48個基因，占PG基因總數的57%。

2.2桃PG基因的系統發育分析和分類

為進一步分析桃PG基因在植物中的進化模式，筆者選取了桃、擬南芥、楊樹、水稻、卷柏和小立碗蘚等6個代表性物種[2，5]中PG蛋白的氨基酸序列使用MEGA5.0軟件，構建了NJ進化樹并對各物種中PG基因進行了聚類分析（圖2）。結果表明，這6個物種的298個PG基因被聚類成7個分支（A～G）。為明確每個物種在每個分支中PG基因的數目，對每個分支中不同物種PG基因的數目進行統計（表2）。結果表明，桃PG基因家族成員存在于所有的A～G等7個分支中，分別含有8、5、15、31、13、9、3個，擬南芥中分別含有8、6、8、20、14、11、1個。楊樹PG基因分布于A～F等6個分支中，分別含有12、7、21、16、14、5個。單子葉植物水稻PG基因也分布于A～F等6個分支中，分別含有7、11、4、9、12、1個。卷柏和小立碗蘚中PG基因數目比較少，卷柏中含有16個，分別為A類2個、B類6個、E類7個、F類1個；小立碗蘚中有11個，分別為A類2個、B類1個、E類8個。統計數據也表明，A、B、E類包含上述6個陸生植物的PG基因；C類、D類只包括桃、擬南芥、楊樹和水稻的PG基因；F類包含桃、擬南芥、楊樹、水稻和卷柏的PG基因；而G類只包括桃和擬南芥的PG基因。

2.3桃PG基因的基因結構分析

為研究桃PG基因的基因結構，根據桃基因組信息獲取每一個PG基因的DNA和CDS序列信息并構建其基因結構（圖3）。結果表明，大部分PG基因都有3～8個不等的內含子，其中分支D中有11個基因不具有內含子結構。通過對基因結構圖和基因進化樹的比較分析，發現每一個分支中PG基因的結構相對是比較保守的，尤其是每一個更小分支中的PG基因。

2.4桃PG蛋白的氨基酸序列比對和保守域分析

為研究桃PG蛋白的保守域，利用CLUSTAL X對桃PG蛋白的氨基酸序列進行多重比對（圖4）。結果表明，PG蛋白一般具有4個典型的保守結構區域（Ⅰ，SPNTDGI；Ⅱ，GDDC；Ⅲ，CGPGHGIS；Ⅳ，RIK）。除了分支G中的3個特殊蛋白不包含這4個結構域之外，分支A～F中的蛋白都至少具有其中一個結構域。尤其是分支A、B、C、F中的蛋白一般都具有所有4個結構域，而分支E中的13個蛋白一般只具有Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ這3個結構域，都缺少結構域Ⅲ。 另外，利用MEME軟件對桃PG保守基序的分析（圖5），發現了6個比較保守的基序（motif 1～6），其中motif 1、motif 5、motif 2和motif 3分別對應Ⅰ～Ⅳ 4個保守結構域。另外，還分別在74、76個PG蛋白中發現了motif 4和motif 6。

2.5桃PG基因的表達分析

利用 UniGene 數據庫進行的組織表達。結果表明，有 10 個基因在數據庫中有表達數據（圖6）。其中有6個基因具有組織表達特異性，[WTBX][STBX]PpaPG10、PpaPG65、PpaPG66、PpaPG67、PpaPG68[WTBZ][STBZ]在果實中特異表達，[WTBX][STBX]PpaPG60[WTBZ][STBZ]在莖中特異表達。對另外4個非組織特異表達的基因，[WTBX][STBX]PpaPG01[WTBZ][STBZ]在莖中表達量比較高，[WTBX][STBX]PpaPG23[WTBZ][STBZ]主要在果實中表達，而[WTBX][STBX]PpaPG80[WTBZ][STBZ]在葉中具有比較高的表達。

3結論與討論

PG家族是一個大的基因家族。在不同物種中，PG基因的進化和分類已經被進行了大量的研究。Park等通過聚類分析，將藻類到陸生植物的PG基因家族成員進行了詳細的劃分[8]。8個物種的225個PG成員被聚類到A～F等6個分支，分支A、分支B包含所有陸生植物的PG基因，分支E包含藻類到開花植物的PG成員，而分支C、D、F則只含有開花植物的PG成員[6]。本研究對桃、擬南芥、楊樹、水稻、卷柏和小立碗蘚等6個代表性物種中的298個PG基因構建了進化樹和聚類分析，將PG基因聚類到A～G等7個分支。桃和擬南芥PG基因家族成員存在于所有的A～G等7個分支中，楊樹和水稻PG基因分布于A～F等6個分支中，卷柏PG基因分布于分支A、B、E、F中，小立碗蘚PG基因僅分布于分支A、B、E等3個分支中。與Park等的研究結果[6]不同的是，分支F中存在1個卷柏PG基因，因此F亞類應該包含除苔蘚以外的所有陸生植物的PG基因。

桃、擬南芥、水稻、楊樹基因組大小分別為230、125、466、480 Mbp，而這4個物種基因組中PG基因的數目分別為84、68、44、75個，說明桃基因組中PG基因出現了基因的擴增。進一步對這4個物種每個分支中PG基因數目進行統計和比較發現，桃的分支C、分支D分別包含15、31個PG基因，明顯比其他物種在這2個分支中PG基因多，說明桃PG基因的擴增主要出現在這2個分支中。基因擴增是基因組進化最主要的[CM（25]驅動力之一，是產生具有新功能的基因和進化出新物種的[CM）][FL）]

主要原因之一。基因可以通過多種方式進行擴增，包括全基因組復制、串連復制、片段復制和逆轉座復制等。對桃PG基因染色體定位進行研究發現，PG基因在染色體上，分布存在明顯的串聯重復現象，共有16個串聯重復基因簇，包含48個基因，占PG基因總數的57%，表明串聯重復是桃PG基因擴增的主要方式。分支C中有4個串聯重復基因簇，包含13個基因；分支D有7個串聯重復基因簇，包含22個基因。表明桃PG基因的串聯重復主要發生在分支C和分支D中。基因擴增后會產生大量的基因重復，基因重復在生物系統進化中發揮著極其重要的作用，是基因組和遺傳系統分化的重要推動力[23]。一般認為，復制基因在進化過程中有4種命運，即假基因化、[JP2]保持原有基因功能、亞功能化、新功能化。桃基因組中大量重復PG基因的進化命運仍需要進一步研究。[JP]

桃的使用主要是鮮食和加工2種方式，而這2種方式對果實的硬度和成熟度要求不同[24-26]。PG基因已被證明在果

實成熟和軟化過程中具有重要作用。在桃UniGene 數據庫中找到了10個有表達數據的PG基因，其中有9個基因均在果實中表達，而且有5個基因是在果實中特異表達，表明PG基因在桃果實發育過程中扮演者重要角色。對桃PG基因與果實發育關系研究能夠為培育符合市場需求的桃優良品種提供重要的理論依據，并具有現實的指導意義。

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