高效降解棉酚菌株的篩選及脫毒條件的研究

侯敏，包慧芳，王寧，詹發強，楊蓉，龍宣杞，崔衛東

(新疆農業科學院微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物實驗室，烏魯木齊　830091)

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高效降解棉酚菌株的篩選及脫毒條件的研究

侯敏，包慧芳，王寧，詹發強，楊蓉，龍宣杞，崔衛東

(新疆農業科學院微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物實驗室，烏魯木齊830091)

摘要：【目的】選育降解棉酚菌株，組建復合菌系，優化固體發酵條件。【方法】從實驗室已有菌株、動物新鮮糞便和土壤中篩選降解棉酚菌株，確定共生菌株混合配比，采用響應面法評價水分、接種量、發酵天數及其交互作用對棉酚降解率的影響，在此基礎上，對主要影響因素進行回歸分析。【結果】選育出10株符合《飼料添加劑品種目錄(2013)》中規定的降解棉酚菌株，確定共生菌株最優配比為QC-3∶QC-5∶QC-9∶QC-10按1∶2∶1∶1，最優的固體發酵培養條件為水分68.8%、接種量12.8%、發酵天數42.5 d，在此條件下脫毒率可達到91.4%。【結論】確定了混合菌發酵棉秸稈脫毒的最佳條件，為混合菌棉秸稈固體發酵降低游離棉酚含量的研究提供了相應的工藝參數和理論依據。

關鍵詞：棉稈；棉酚；脫毒；固體發酵

0引 言

【研究意義】新疆是我國重要的棉花生產基地，棉花種植面積約 133. 3 ×104hm2(2 000 萬畝)，據統計新疆棉秸稈總產量 2013 年超過 800×104t。從2012年起，新疆啟動《新疆新增1 000萬只出欄肉羊綜合生產能力建設規劃 (2012～2015年)》，提出的北疆圍繞畜牧業、南疆圍繞林果業，調優種植結構的要求，著力加強飼草料生產保障體系建設。魏敏等[1]測定出新疆奎屯棉花秸稈中粗蛋白6.5%，比玉米秸稈、稻草和小麥秸稈的粗蛋白含量都要高。棉酚是錦葵科棉屬植物色素腺產生的多酚二萘衍生物俗稱棉毒素，是棉花秸稈作為飼料的限制因素。存在形式有兩種，即結合棉酚 (boundgossypol) 和游離棉酚 (freegossypol)。含有一定量的游離棉酚(freegossypol)，可以導致動物生長受阻、生產力下降、貧血、呼吸困難、繁殖力下降、甚至不育，嚴重時可致死亡[2]。所以，降解棉酚含量、提高其營養及適口性，是棉稈成為動物飼料的當務之急。【前人研究進展】生物發酵法被普遍認為是當前最安全、脫毒效果好、生產成本低、最有發展前途的脫毒方法[3]。采用微生物發酵將棉酚轉化為其他物質，達到脫毒目的，同時又可提高粗飼料的營養價值，增加適口性和采食量[4]。棉酚生物降解的研究歷史由來已久。Reiser[5]發現反芻動物瘤胃中的微生物和酶作用于棉酚，其被破壞并隨纖維素而水解轉入真胃中，相對解決了棉酚的毒性問題；此外還發現在霉變的棉籽餅中棉酚含量也非常低，說明其中所生長的某類霉菌對游離棉酚可能存在降解作用[6]。目前，國內所篩選的降解棉酚菌種主要是黑曲霉[7]和產阮假絲酵母[8-9]兩類。【本研究切入點】近年來，運用微生物發酵處理棉稈，主要應用于生物肥料，大部分實驗菌株不符合農業部對飼料微生物添加劑的規定。【擬解決的關鍵問題】篩選較高降解棉酚能力且適用于飼料發酵的益生菌株，并采用響應曲面法進行固體發酵工藝條件的研究，達到最好的脫毒效果及提高棉稈營養價值。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1醋酸棉酚

醋酸棉酚：購自上海生物工程有限公司，純度99%。

1.1.2樣 品

實驗室已有菌株；五家渠棉花種植地土壤；吐魯番鄯善縣魯克沁鎮牧場牛、羊、駱駝新鮮糞便。

1.1.3培養基

MRS培養基、YPD培養基、LB培養基、NA培養基見《微生物學實驗技術》[10]。以醋酸棉酚為唯一碳源的培養基：醋酸棉酚5.0 g，(NH4)2SO22.0 g，MgSO·7H2O 0.2 g，NaH2PO4·H2O 0.5 g，CaCl2·H2O 0.1 g，K2HPO40.5 g。瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。固態發酵培養基：五家渠農戶粉碎棉秸稈。

1.2方 法

1.2.1初篩棉酚降解菌株

取1 g新鮮土樣(牛、羊、駱駝新鮮糞便)于9 mL無菌水中，經過梯度稀釋，涂布于初篩培養基平板上，35℃恒溫倒置培養48 h，挑取分離得到的形態不同的單菌落，分別轉接到以醋酸棉酚為唯一碳源的平板培養基上，然后倒置于35℃培養箱中培養48 h。挑選能夠生長的菌株轉接至NA培養基斜面上，35℃恒溫培養24 h，置于4℃冰箱保存。

將實驗室現有菌株分別在棉酚濃度為100、200 、300 、400 、500 和1 000 mg/kg的NA培養基平板中35℃培養48 h，觀察菌株的生長狀況，挑選耐受棉酚菌株。

1.2.2復篩棉酚降解菌株

將初篩耐受棉酚的菌種制備成活菌數為1010～1011CFU的菌懸液，固體培養基棉秸稈處理為1～2 cm長度，加水量60%，接菌量5%，混勻，裝入1 L的太空杯中。對照組加入5%的無菌生理鹽水替代菌懸液。置于室溫發酵30 d后，自然晾干，粉碎，過40目篩，測定發酵前后的棉酚含量，根據棉酚降解率，選擇優良菌株。

1.2.3菌株間拮抗實驗

將篩選得到的菌株在牛肉膏蛋白胨培養基平板上兩兩交叉劃線，倒置放于35°C的培養箱中培養3 d，觀察交叉點菌株生長情況。交叉點菌株不生長的為菌株之間有拮抗作用，實驗選用不產生拮抗作用的菌株并進行合理組合。

1.2.4棉酚降解菌株分子生物學鑒定

采用美國ZR Fungal/Bacterial DNA KitTM試劑盒提取菌株基因組。利用通用引物擴增細菌16s rDNA或真菌18s rDNA。PCR擴增反應體系為50 μL，含有24 μL premixTaq，引物各1 μL，模板2 μL，無菌水22 μL。16s rDNA擴增條件：94℃ 4 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 90 s，30個循環；72℃ 10 min；18s rDNA擴增條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，52℃ 60 s，72℃ 90 s，30個循環；72℃ 10 min。擴增產物經l%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，測序由上海生物工程有限公司完成。將測序得到的序列與GenBank數據庫中的核苷酸序列進行BLAST分析，從中獲取相近的序列，用ClustalX 軟件和 MEGA 6.0 中的Neighbor-joining 法構建系統進化樹。根據我國農業部《飼料添加劑品種目錄(2013)》中規定的可以直接飼喂動物的飼料級微生物添加劑菌種，篩選出適用于飼料發酵的降解株菌。

1.2.5確定混菌配比

挑選4株共生菌，分別準備種子培養液，設計不同混合配比進行固體發酵實驗。在室溫下，以5%的接菌量、60%的含水量、發酵30 d。列出混合配比試驗設計。表1。

表1混菌混合配比實驗設計

Table 1The design of mix strain rate

名稱Primername菌株1Strain1菌株2Strain2菌株3Strain3菌株4Strain41111122111312114112151112CK0000

1.2.6棉秸稈固體發酵條件優化

以棉稈為底物，按照試驗設計，室溫下做發酵瓶裝試驗。以Y游離棉酚的含量為指標，考察以發酵初始加水量X1、接種量X2、發酵時間X3為試驗因素，進行二次回歸中心組合試驗設計，擬合自變量與響應值之間的函數關系。其中加水量為50%、60%、70%；接種量為5%、10%、15%；發酵時間為30、45、60 d。

1.2.7測定棉酚含量

按國標GB13086-91《飼料中游離棉酚的測定方法》測定。

2結果與分析

2.1棉酚降解菌的分離篩選

采用以醋酸棉酚為唯一碳源培養基，從五家渠棉花種植地土壤、吐魯番鄯善縣魯克沁鎮牧場牛、羊、駱駝新鮮糞便和實驗室已有菌株中篩選耐受棉酚菌株25株。挑選長勢好的菌株10株，經搖瓶發酵后，以5%的添加量，加入1L棉稈中，進行固體發酵實驗。發酵30 d后，檢測棉稈中游離棉酚的含量。CK棉稈中的棉酚含量為326 mg/kg，菌株QC-3的棉酚降解率為69.6%，菌株QC-10的棉酚降解率為69%。另外，菌株QC-1的棉酚降解率為59.2%，菌株QC-4的棉酚降解率為52.1%，菌株QC-6的棉酚降解率為64.7%，菌株QC-7的棉酚降解率為64.1%，各個菌株對棉酚都有一定程度的降解。表2

表2　單個菌株對棉稈中棉酚降解

2.2菌株間拮抗實驗

將篩選得到的菌株在以醋酸棉酚為唯一碳源的NA培養基平板上兩兩交叉劃線，倒置放于35°C的培養箱中培養3 d，觀察交叉點菌株生長情況。結果顯示。交叉點處，菌株沒有生長或有生長緩慢的現象，說明兩菌株間產生拮抗作用；交叉點處，菌株生長良好，說明兩菌株間沒有產生拮抗作用。QC-3、QC-5、QC-9與QC-10兩兩之間沒有拮抗作用，挑選進行后續實驗。圖1

2.3分子鑒定及系統發育

棉酚降解菌的基因組 16S rDNA和18S rDNA 的 PCR 擴增產物，所獲得的棉酚降解菌 16S rDNA 和18S rDNA 序列經生物公司測序后，與GenBank中相關數據庫進行相似性分析，利用MEGA 6.0 中的Neighbor-joining 法構建系統進化樹。菌株QC-3與Candidautilis(AF239662) 處于最小分支，是Candidautilis(AF239662) 的近似種；菌株QC-5與BaclicuslincheniformisPFL (AJ577854.1) 處于最小分支，是BaclicuslincheniformisPFL (AJ577854.1) 的近似種；QC-9與LctobacillusplantarumB21 (NZ_CP010528.1) 處于最小分支，是LctobacillusplantarumB21 (NZ_CP010528.1) 的近似種；QC-10與Bacillussp. cp-p (EU584531) 處于最小分支，是Bacillussp. cp-p (EU584531) 的近似種。圖2

圖1　拮抗性試驗結果

圖2　菌株系統發育樹

2.4最佳混菌配比確定

結合生產實際，將菌株QC-3、QC-5、QC-9與QC-10進行一定比例的混合。室溫下，以5%的接菌量、60%的含水量、發酵30 d。對照CK棉酚含量為283.3 mg/kg，當混菌QC-3∶QC-5∶QC-9∶QC-10按1∶1∶1∶1的比例添加時，脫毒率達到76.8%；當混菌按2∶1∶1∶1的比例添加時，脫毒率達到83.9%；當混菌按2∶1∶1∶1的比例添加時，脫毒率達到83.9%；當混菌按1∶1∶2∶1的比例添加時，脫毒率達到84.1%；當混菌按1∶1∶1∶2的比例添加時，脫毒率達到80.2%；當混菌按1∶2∶1∶1的比例添加時，脫毒效果最好，脫毒率達到86.4%。混合菌液體發酵實驗結果。表3

2.5棉秸稈固體優化結果

結合生產實際，以脫毒率為響應變量，并以固體發酵的水分、接種量、發酵天數為影響因子，進行3因素3水平的Box-Behnken響應面分析試驗。試驗設計與結果中可以看出，試驗組2，發酵條件為接種量10%、發酵時間45 d、水分60%時，脫毒效果最好，脫毒率為91.1%。表4，表5

采用Design Expert軟件對試驗數據進行響應面方差分析，得出二次模型回歸統計分析表，尋求最佳響應因子水平。對表中數據進行回歸分析，得到脫毒率對水分、接種量、發酵天數的二次多項回歸方程：脫毒率%=89.82+0.15×A+2.84×B+0.79×C+3.27×A×B-1.38×A×C-2.30×B×C-0.84×A2-5.11×B2-4.71×C2。表6

研究表明，失擬項不顯著P>0.05，而模型的P值<0.05，表明模型顯著。一次項B，二次項B2、C2對結果影響顯著，一次項A、C，交互項AB、AC、BC，二次項A2對結果影響不顯著。手動對回歸模型進行優化，優化后的回歸方程為：脫毒率%=89.47+2.84×B+0.79×C-5.15×B2-4.75×C2。表6

表3　混菌混合配比實驗結果

表4　因素水平

表5　Box- Behnken 設計方案及響應值結果

表6　二次響應面回歸模型方差分析

失擬項不顯著P>0.05，而模型的P<0.01，表明模型高度顯著。優化后模型F-value值和模型lack of fit 值變化不大，表明新的擬合方程仍能夠滿足響應面分析的要求，可以用此模型對固體發酵最優條件進行分析和預測。當發酵條件為水分68.8%、接種量12.8%、發酵天數42.5 d，脫毒率可達到91.4%。采用上述最優條件進行驗證試驗，試驗測得脫毒率為91.3%。表7

表7　優化后結果

3討 論

3.1從實驗室已有菌株、動物新鮮糞便和土壤中選育出10株符合《飼料添加劑品種目錄(2013)》中規定的降解棉酚菌株。微生物發酵棉秸稈作為動物飼料，脫毒的關鍵是菌種的選擇。不同微生物菌種對棉酚的降解能力不同，篩選優良的微生物菌種是影響棉秸稈脫毒效果的首要條件。在國內外，常采用單一菌種進行微生物固體發酵脫毒。孫建義等[11]利用假絲酵母進行棉籽餅脫毒的研究，棉酚脫毒率達90.0%以上；楊繼良等[12]篩選出脫毒能力較強的酵母菌菌株JM-3，該菌株可降解棉籽餅中80%以上的游離棉酚；顧賽紅等[13]利用黑曲霉PES對棉仁粕進行固體發酵，游離棉酚由498.0 mg/kg降為57.0 mg/kg，脫毒率達86.5%。

3.2除了微生物菌種的影響外，固體發酵過程中含水量﹑接種量﹑發酵天數﹑輔料添加等對發酵效果有著很大的影響。賈曉峰[14]利用微生物處理棉籽粕，發酵培養基中添加了麩皮、玉米粉等輔料，料水比為1∶0.9，脫毒率達90.0%左右；聶蓬勃[15]將棉籽粕50.0℃烘干，料水比為1∶1，脫毒率在51.7%。周生飛[16]利用響應面分析法建立棉酚降解率與關鍵因素之間的二次多項式回歸模型，并通過模型求解確定培養基最佳成分和最優發酵條件：Na2CO30.6 g/L，FeSO472.7 mg/L，MgSO40.6 g/L，水分含量 58.1%和發酵時間 31.6 h，預測最大棉酚降解率為 60.94%。通過優化棉秸稈固體發酵條件，建立了關鍵因子影響棉秸稈脫毒率的二次多項數學模型，系統研究并確定了棉秸稈固體發酵脫毒的工藝條件，為實現棉秸稈微生物發酵作為動物飼料提供了理論依據。通過響應面試驗設計得到水分﹑接種量﹑發酵天數對棉酚降解率影響的數學模型。

4結 論

4.1采用醋酸棉酚基礎培養基從五家渠棉花種植地土壤、吐魯番鄯善縣魯克沁鎮牧場牛、羊、駱駝新鮮糞便和實驗室已有菌株中篩選菌株25株。選育出10株符合《飼料添加劑品種目錄(2013)》中規定的降解棉酚菌株。選用不產生拮抗作用的菌株并進行合理組合，確定共生菌株最優配比為QC-3∶QC-5∶QC-9∶QC-10按1∶2∶1∶1。菌株QC-3、QC-5、QC-9、QC-10分別為產朊假絲酵母(Candidautilis)、地衣芽孢桿菌(Baclicuslincheniformis)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

4.2以生產實際相結合，利用響應面分析法以游離棉酚含量為指標，以發酵水分、接種量、發酵天數為試驗因素，進行二次回歸中心組合試驗設計。通過Design Expert 8.0.6軟件對經手動優化后的回歸方程求解，在試驗的因素水平范圍內預測最佳發酵條件為：水分68.8%、接種量12.8%、發酵天數42.5 d，在此條件下脫毒率可達到91.4%。采用上述最優條件進行驗證試驗，試驗測得脫毒率為91.3%。

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Fund project:Supported by the Youth Funds of Xinjiang Academy of Agricultural Sciences "Screening and Breeding of Highly-Effected Degrading Gossypol Strains and the Detoxification Effect Demonstration" (xjnkq-2014009) and the Basic Science and Technology Research Support Funds of Non-profit Research Institutions of Xinjiang Uygur Autonomous Region "Microbial Treatment Technology of Cotton Stalks" (KY2014028)

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2016.06.019

收稿日期(Received)：2016-01-14

基金項目:新疆農業科學院青年科技基金項目“棉酚降解菌株選育及在棉稈發酵中的初步應用”(xjnkq-2014009); 自治區公益性科研院所基本科研業務經費資助項目“棉秸稈飼料化微生物處理技術研究”

作者簡介:侯敏(1983 -)，女，新疆人，助理研究員，研究方向為農業微生物及發酵工程，(E - mail) hmde_092@ 163. com 通訊作者(Cotresponding author):崔衛東(1969-)，男，新疆人，研究員，研究方向為發酵工程，(E - mail)cuwedo@163.com

中圖分類號：F303.2 S188

文獻標識碼：A

文章編號：1001-4330(2016)06-1114-08

Screening and Breeding of Highly-Effected Degrading Gossypol Strains and Study on Defoxication Technology and Conditions

HOU Min, BAO Hui-fang, WANG Ning, ZHANG Fa-qiang, YANG Rong,LONG Xuan-qi, CUI Wei-dong

(ResearchInstituteofAppliedMicrobiology/XinjiangAcademyofAgriculturalSciences/XinjiangLaboratoryofSpecialEnvironmentalMicrobiology,Urumqi830091,China)

Abstract：【Objective】 The project aims at screening and breeding of degrading gossypol strains and studying the defoxication technology and conditions.【Method】From the existing strains in the laboratory, animal feces and different samples of soil were screened and bred degrading gossypol strains were screened and bred to identify the symbiotic strains mixing ratio, then, moisture, inoculation amount, fermentation time and their interactions on the degradation rate of glucosinolate were evaluated by using a response surface method. Based on this, the optimal levels of these factors were determined by Box-Behnken. 【Result】Ten degrading gossypol strains were bred, and the most optimal rate was 1∶2∶1∶1, The high degradation rate of gossypol was observed in fermentation processes under the optimal conditions: the moisture was 68.75%, the inoculation amount was 12.76%, fermentation time was 42.53 d. Under these conditions, the degradation rate of gossypol reached 91.422,9% .【Conclusion】In conclusion, the optimal fermentation conditions of the detoxification conditions are determined. The results can be used as technical parameters and theoretic basis for decreasing the degradation rate of gossypol with mixture strain on cotton stalks.

Key words:cotton stalk; gossypol: detoxication, solid fermentation