福建地區2株豬嵴病毒VP1基因的克隆及遺傳進化分析

張永軍，胡永浩

(1.中農威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州 730046；2.甘肅農業大學動物醫學院，甘肅蘭州 730070)

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福建地區2株豬嵴病毒VP1基因的克隆及遺傳進化分析

張永軍1，胡永浩2*

(1.中農威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州 730046；2.甘肅農業大學動物醫學院，甘肅蘭州 730070)

摘要[目的]調查豬嵴病毒在福建地區腹瀉豬群中的流行和變異情況。[方法]根據GenBank中登陸的豬嵴病毒(porcine kobuvirus，PKoV)結構蛋白VP1基因序列設計特異性引物，采用RT-PCR方法從某豬場采集腹瀉小腸樣品中擴增豬嵴病毒VP1基因，將擴增后的目的片段克隆后進行序列測定。應用生物信息學軟件，將獲得的2株豬嵴病毒VP1和GenBank的豬嵴病毒株VP1基因序列進行對比分析。[結果]豬嵴病毒CH/FJNP/12L/2015與匈牙利株K-30-HU/2008/HUN(GQ249161)的核苷酸同源性最高，為88.1%，氨基酸同源性為95.3%。 CH/FJNP/12W1/2015與越南株714441/CAOLANH-VH/2012-2-21(KT266058)的核苷酸同源性最高，為88.2%，氨基酸同源性為96.1%，同源重組分析顯示，2株毒株均無明顯同源重組發生。[結論]頻繁的畜禽國際貿易，以及如今便捷的現代化交通工具，人們生活提供方便的同時，也加速了豬嵴病毒毒性的傳播。

關鍵詞豬嵴病毒；VP1基因；同源性

嵴病毒屬小RNA病毒科嵴病毒屬成員，病毒粒子呈球形，無囊膜，直徑為27～30 nm。其衣殼呈二十面體，由3種結構蛋白(VP0、VP3和VP1)組成的60個不對稱亞單位構成。病毒基因組為單股正鏈RNA，其標準毒株人愛知病毒(Aichi virus，AiV)、牛嵴病毒(Bovine kobuvirus，BKoV)、豬嵴病毒(Porcine kobuviruses，PKoV)和已公布羊嵴病毒(Sheep kobuvirus，SKoV)、狗嵴病毒(Canine kobuvirus，CKoV)。2007年匈牙利學者最早在豬糞便中檢測諾瓦克(Norovirus)和札幌病毒病毒(Sapovirus)時發現了豬嵴病毒(S-1-HUN/2007/Hungary)，并對其全基因組進行生化測序[1]。我國豬庫博病毒的最早報道為2009年，研究者對2006～2007年收集自河北省322份<15日齡仔豬的糞便樣品進行檢測發現有97份豬庫博陽性，陽性檢出率為30%[2]。研究發現，病毒在無腹瀉臨床表現的健康豬中也頻繁被檢出，且隨豬齡的增長，病毒在糞便中的檢出率降低。研究表明，豬庫博病毒的傳播與豬腹瀉直接相關[3]，豬血清中檢測到病毒RNA和易感病毒粒子也說明庫博病毒病毒血癥的存在，通過對病毒全基因組序列比較分析病毒nt/aa的變異，表明病毒與宿主發生了很好的相互適應[4]。Jin等[5]對江蘇省樣品進行調查，結果發現，腹瀉樣品豬嵴病毒陽性率為64.8%(59/91)，健康樣品中豬嵴病毒陽性率為19.8%(25/126)，說明豬嵴病毒在江蘇省普遍流行，推測豬嵴病毒是潛在的仔豬腹瀉誘因。

豬嵴病毒與小RNA病毒科其他病毒相似，蛋白之間的裂解位點多位于Glu和Gly、Ala之間，據此劃分了已知的各嵴病毒標準株基因組。所有嵴病毒都有相似的基因組結構：VPg-5′UTR-(L蛋白)-結構蛋白P1(VP0-VP3-VP1)-非結構蛋白(P2-P3)-3′UTR-poly(A)。VP1蛋白是小RNA病毒科變異最為頻繁的結構蛋白，其含有主要的抗原表位。筆者以2015年福建地區腹瀉嚴重的規模化豬場為研究對象，選取代表性豬場豬嵴病毒的VP1基因序列與參考序列進行遺傳進化分析，以期為該病毒在自然界進行和流行病學研究提供參考。

1材料與方法

1.1樣品采集與處理2015年收集福建2個不同地區的規模化豬場4～7日齡表現嘔吐、水樣腹瀉和嚴重脫水的仔豬腸內容物，按照1∶5比例加入PBS，然后置于QIAGEN TissueLyserII研磨，-80 ℃反復凍溶2次，8 000 r/min離心10 min，吸取上清，凍存備用。

1.2主要試劑PrimeSTAR HS DNA Polymerase、T4 DNA快速連接酶購自Promega公司；MiniBest Plasmid Purification Kit、Agarose Gel DNA Purification Kit、DH5α大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態細胞限制性內切酶等均為大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)產品。

1.3豬嵴病毒Real-time PCR檢測根據已建立的豬嵴病毒Real-time PCR檢測方法。Kub-F：5′-AGATATGGACAAACCCTGGCCC-3′，Kub-R：5′-GATCGCCTCCTCCATTGTCAGA-3′。Kub-Probe：5′-ACTCGAGGCGGCCGCCGACG-3′(5′HEX，3′TAMRA)。以RNA提取物為模板進行RT-PCR擴增，25 μL反應體系：2×One Step RT-PCR BufferⅢ(含dNTP Mixture，Mg2+)12.5 μL，TaKaRa ExTaqHS(5 U/μL)0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ 0.5 μL，RNase Free dH2O 7.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，Probe 1.0 μL，RNA 2.0 μL。PCR擴增采用Agilent Techologies-Mx3005pPCR擴增儀，反應程序：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，1個循環(反轉錄)95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃30 s，40個循環(PCR擴增)，其中，熒光信號收集設置在每一循環的72 ℃ 30 s末。

1.4豬嵴病毒VP1基因擴增及測序將上述檢測為陽性的不同豬場RNA樣品各選取3份，參考文獻[6]引物及PCR擴增條件進行VP1基因擴增，用一步法反轉錄擴增試劑盒，50 μL體系用擴增VP1引物得到預期1 100 bp大小的目的基因，并將其克隆到pMD20-T載體，每個克隆不少于3個克隆進行測序。

1.5遺傳進化分析 用DNAStar軟件將豬嵴病毒VP1基因和GenBank數據庫中參考株的VP1基因進行比對分析，利用MEGA 6.0中的NJ(Neighbor-joining)法構建系統發育進化樹。

1.6重組分析用simplot 3.5.1軟件將分離的2株豬嵴病毒VP1基因和比對同源性最高的參考序列進行同源重組分析，分析毒株間是否發生同源重組。

2結果與分析

2.1豬嵴病毒檢測 檢測樣品均為福建2個不同地區的規模化豬場4～7日齡的腹瀉仔豬腸內容物，每個地區選取10份病料，用Real-time PCR檢測，結果發現病料均為豬嵴病毒陽性。

圖1　Real-time PCR病料檢測結果Fig.1　Result of Epidemic Material with Real-time PCR

2.2豬嵴病毒VP1基因的擴增及酶切鑒定應用特異性引物，以提取的病毒總RNA為模板，對上述毒株進行RT-PCR，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增出大小為762 bp的特異性目的條帶，純化回收后與pMD20-T克隆載體連接、轉化，用NdeI/BamHI進行雙酶切后，得到2個大小約2.7 kb與762 bp的片段，對應于載體和目的基因VP1的大小(圖2)，表明重組質粒為陽性。

注：1.重組質粒單酶對照；2.重組質粒雙酶切產物；M.5 000 DNA分子量標準。Note：1.Recombinant plasmid with NdeI 2.Recombinant plasmid with NdeI and BamHI M.DL DNA Marker(5 000 3 000 2 000 1 500 1 000 750 500 250 100)圖2　含有VP1的重組質粒NdeI/BamHI雙酶切鑒定結果Fig.2　Result of Recombinant Plasmid with NdeI and BamHI

2.3豬嵴病毒VP1基因分析及遺傳進化分析從4～7日齡的腹瀉仔豬腸內容物樣品中各選取一株為代表株，分別命名為CH/FJNP/12W1/2015和CH/FJNP/12L/2015，其序列登陸至GenBank。將上述2株分別與已公布的我國其他地區的豬嵴病毒VP1序列進行比對，結果顯示，CH/FJNP/12W1/2015與我國其他地區的核苷酸同源性81.1%～87.5%，與GS-2/2012-CH的同源性最高為87.5%。CH/FJNP/12L/2015與我國其他地區的核苷酸同源性為81.2%～87.3%，與CH/DX/2012的同源性最高為87.3%。遺傳進化分析顯示所有已知的豬嵴病毒VP1序列形成2個主要分支，分離自福建2株毒株分別位于2個分支(圖3)。

圖3　基于豬嵴病毒已公布和福建地區毒株VP1基因遺傳進化分析Fig.3　Genetic evolution analysis of VP1 in Fujian based on swine viruses published

2.4同源重組分析將分離的2株豬嵴病毒VP1基因CH/FJNP/12L/2015和CH/FJNP/12W1/2015，和進化分析比對同源性最高的714441/CAOLANH-VH/2012-2-21(KT266058)、K-30-HU/2008/HUN(GQ249161)和S-1-HUN 2007 Hungary(EU787450)進行同源重組分析，結果顯示，CH/FJNP/12L/2015和CH/FJNP/12W1/2015分別作為研究父本，與參考序列同源重組比對均無明顯重組。

注：A.CH/FJNP/12L/2015作為父本，B.CH/FJNP/12W1/2015作為父本。Note：CH/FJNP/12L/2015 as parental strain in A，CH/FJNP/12W1/2015 as parental strain in B.圖4　同源重組分析Fig.4　Analysis of homologous recombination

3結論與討論

豬嵴病毒屬于小RNA病毒科的成員，其基因組序列在與外界環境適應的過程中容易發生變異，國內外研究表明，發生腹瀉的仔豬其豬嵴病毒檢出率明顯高于未發生腹瀉的豬群，因此推測豬嵴病毒在仔豬腹瀉中扮演著一定的作用，但是因為豬流行性腹瀉病毒的大規模流行，加速豬嵴病毒在豬群中的感染，還是豬嵴病毒協同豬流行性腹瀉病毒從而導致仔豬腹瀉的大范圍暴發，仍需要2種病毒的分離及致病性試驗才能定論。

該研究分離的2015年福建豬嵴病毒VP1序列CH/FJNP/12W1/2015與越南株714441/CAOLANH-VH/2012-2-21(KT266058)的核苷酸同源性最高，為88.2%，氨基酸同源性為96.1%。越南為我國鄰國，CH/FJNP/12W1/2015與越南毒株高度同源，推測可能是兩國頻繁的畜禽貿易，促進了豬嵴病毒毒株的傳播。另一株豬嵴病毒CH/FJNP/12L/2015與匈牙利株K-30-HU/2008/HUN(GQ249161)的核苷酸同源性最高，為88.1%，氨基酸同源性為95.3%。匈牙利為歐洲中部內陸國家，2015年出現與匈牙利具有高度同源性的豬嵴病毒，推測可能也是頻繁的畜禽國際貿易，及如今便捷的現代化交通工具，在給人們生活提供方便的同時，也為豬嵴病毒毒株的傳播提供了條件。該研究對我國福建地區腹瀉仔豬豬嵴病毒的感染狀況進行初步調查，并對VP1基因序列遺傳進化生物分析，以期為該病毒在自然界進化和流行病學研究提供參考。

參考文獻

[1] REUTER G，BOLDIZSAR A，PANKOVICS P.Complete nucleotide and amino acid sequences and genetic organization of porcine kobuvirus，a member of a new species in the genus Kobuvirus，family Picornaviridae[J].Archives of virology 2009，154(1)：101-108.

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[5] JIN W J，YANG Z，ZHAO Z P，et al.Genetic characterization of porcine kobuvirus variants identified from healthy piglets in China[J].Infection，genetics and evolution，2015，35：89-95.

[6] WANG C，LAN D，CUI L，et al.Molecular characterization of a porcine kobuvirus strain in China[J].Archives of virology，2012，157(3)：573-578.

基金項目中國農業產業體系(CARS-39)。

作者簡介張永軍(1982- )，男，甘肅靖遠人，獸醫師，從事動物疫病監測與防治研究。*通訊作者，教授，博士，博士生導師，從事預防獸醫學研究。

收稿日期2016-04-22

中圖分類號S 852.65+1

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)14-149-03

Cloning of Porcine KobuvirusVP1 in Fujian province and Phylogenetic analysis

ZHANG Yong-jun1, HU Yong-hao2*

(1.China Agricultural Vet.Bio.Science and Technology Co.,Lanzhou,Gansu 730046;2.College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou,Gansu 730070)

Abstract[Objective] The current situation of the epidemic and genetic variation of the porcine Kobuvirus (PKV) in diarrhea pigs in Fujian province were investigated. [Method] The special primer was designed according to the sequence of PKV deposited in GenBank. The VP1 gene of PKV in intestinal samples collected from pig-raising farm was amplified with RT-PCR method, and then, the amplified target fragment was cloned and sequenced. The sequences of two PKV strains were analyzed and compared by means of bioinformatics software. [Results] The results showed that there was high nucleotide homology between VP1 gene of CH/FJNP/12L/2015and K-30-HU/2008/HUN, which was 88.1%; amino acid homology, 95.3%. The homology in the nucleotide and amino acid of CH/FJNP/12W1/2015 with 714441/CAOLANH-VH/2012-2-21 was 88.2% and 96.1%, respectively. The two isolates had no obvious homologus recombination occurred with other strains. [Conclusion] speculated that the frequent international livestock trade, and is now a modern and convenient means of transport, in convenience to our lives, but also accelerate the spread of swine crest virus strains. [Conclusion] It is speculated that it resulted from the frequent international trade of livestock and poultry, and convenient modern transportation tools, which also accelerated the transmission of PKV.

Key wordsPorcine kobuviruses; VP1 gene; Homology