MT01/PEN復合物對人成骨樣細胞MG63表達骨保護蛋白和核因子κB受體活化因子配體的影響

崔野鄭義申玉芹侯旭婁譯心孫新華

1.吉林大學口腔醫院正畸科；2.吉林省牙發育及頜骨重塑與再生重點實驗室；3.吉林大學口腔醫院牙周病科，長春 130021

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MT01/PEN復合物對人成骨樣細胞MG63表達骨保護蛋白和核因子κB受體活化因子配體的影響

崔野1，2鄭義3申玉芹3侯旭1婁譯心1孫新華1

1.吉林大學口腔醫院正畸科；2.吉林省牙發育及頜骨重塑與再生重點實驗室；3.吉林大學口腔醫院牙周病科，長春 130021

［摘要］目的 應用聚乙烯亞胺陽離子聚合物（PEN）載體裝載寡脫氧核苷酸MT01，制備MT01/PEN復合物，檢測該復合物對人成骨樣細胞MG63表達骨保護蛋白（OPG）和核因子κB受體活化因子配體（RANKL）的影響。方法制備3種不同配比的MT01/PEN（質量比分別為1∶2、1∶4、1∶6）復合物，以全硫代化修飾MT01（MT01-s）和未修飾的MT01作陽性對照，分別轉染MG63細胞。采用酶聯免疫吸附測定法和real-time聚合酶鏈反應法分別檢測培養24、48、72 h時各組上清液及細胞內OPG和RANKL的表達水平。結果 經MT01/PEN復合物轉染后，上清液及細胞內OPG表達水平均升高（P＜0.05）；多數組中RANKL表達水平降低，而OPG/RANKL比值呈升高趨勢（P＜0.05）；不同質量配比的MT01/PEN均對MG63細胞的成骨具有影響，其中質量比為1∶6時作用最明顯。結論 應用PEN作為基因載體裝載MT01可增強MT01對MG63細胞的促成骨作用。

［關鍵詞］人成骨樣細胞MG63； 寡脫氧核苷酸MT01； 聚乙烯亞胺陽離子聚合物； 骨保護蛋白； 核因子κB受體活化因子配體

寡脫氧核苷酸（oligodeoxynucleotides，ODN）是一類單鏈DNA分子［1］。研究［2-4］發現，一種依據人線粒體DNA設計合成命名為MT01的ODN具有促進成骨細胞骨向分化的作用，并可促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化［5］；體內實驗［6］發現，MT01對大鼠正畸牙移動具有抑制作用。

未經修飾的ODN易被核酸酶降解， 細胞攝取率低。為了增強ODN的穩定性，多采用硫代修飾的手段對其進行化學處理，但ODN表面的負電荷影響修飾效果且化學修飾具有毒副作用［1］。近年來，納米技術的發展為解決ODN的傳遞問題提供了新策略。聚乙烯亞胺陽離子聚合物（N-isopropylacrylamidemodified polyethylenimines，PEN）是聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）的衍生物，具有毒性低且裝載效率高等優勢［7］。研究［8］證實，PEN能夠有效裝載MT01，構建MT01/PEN傳輸體系。本研究擬通過檢測MT01/PEN復合物對人成骨樣細胞MG63中骨保護蛋白（osteoprotegerin，OPG）和核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）表達水平的影響，探討MT01/PEN傳輸體系在增強MT01成骨方面的作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與設備

人成骨樣細胞MG63（吉林大學口腔醫院口腔生物醫學工程重點實驗室提供）；MT01及全硫代修飾物MT01-s（5’-ACCCCCTCTACCCCCTCTACCCCCTCT-3’，吉林大學基礎醫學院分子生物學教研室設計，大連TaKaRa公司合成），PEN（吉林大學生命科學學院提供）；高糖DMEM培養基（Hyclone公司，美國），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（PAA公司，奧地利）；OPG/RANKL酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（RD公司，美國），組織細胞總RNA抽提試劑盒（廣州Magen公司），逆轉錄試劑盒（成都福際生物技術有限公司），real-time 聚合酶鏈反應（poly-merase chain reaction，PCR）試劑盒（大連TaKaRa公司）。CO2恒溫細胞培養箱（Sanyo公司，日本），倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本），NanoDrop 2000 分光光度計（Thermo Scientific公司，美國），酶標檢測儀（Rayto公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 MG63細胞培養 選用狀態良好，融合度為80%～90%的MG63細胞，以每孔5×105個細胞的密度接種于6孔板，加高糖DMEM培養基（含10%FBS），在37 ℃，5%CO2恒溫細胞培養箱中孵育24 h。

1.2.2 合成MT01/PEN載體復合物 將MT01和PEN分別用無菌PBS（pH值為7.4）溶解并稀釋至0.1 g·L-1，分別按溶質質量比1∶2、1∶4、1∶6混合均勻，室溫靜置組裝30 min，待用。

1.2.3 轉染MT01/PEN載體復合物至MG63細胞 取孵育24 h的MG63細胞，棄液，PBS溶液沖洗2次，分別取PEN（0.1 g·L-1）60 μL、MT01（0.1 g·L-1）10 μL、MT01-s（0.1 g·L-1）10 μL、MT01/PEN載體復合物（溶質質量比1∶2、1∶4、1∶6）30、50、70 μL及PBS（空白對照），補齊至70 μL后分別加入6孔板中，加高糖DMEM培養基（不含FBS）補至2 mL（各孔MT01終質量濃度0.5 μg·mL-1），與MG63細胞共同孵育4 h，棄液，加高糖DMEM培養基（含10%FBS），繼續孵育24、48和72 h。各實驗組均設3復孔。

1.2.4 檢測OPG和RANKL蛋白的表達水平 應用ELISA試劑盒，分別檢測培養24、48和72 h的MG63細胞中OPG和RANKL蛋白的表達情況，加樣如下（設3復孔）：空白對照孔，不加任何試劑；標準品孔，加入標準品50 μL、鏈霉親和素-辣根過氧化物酶50 μL；待測樣品孔，加入各實驗組上清液40 μL、抗OPG或RANKL抗體10 μL、鏈霉親和素-辣根過氧化物酶50 μL。450 nm波長下檢測各孔吸光度A值，根據標準品質量濃度及對應的A值計算標準曲線直線回歸方程，依據樣品A值計算對應樣品的質量濃度。

1.2.5 檢測OPG和RANKL mRNA的表達水平 吸棄6孔板中上清液，PBS沖洗，每孔加入300 μL胰酶消化，高糖DMEM培養基（含10%FBS）終止后離心收集細胞。采用HiPure Total RNA試劑盒提取各組細胞內的總RNA，通過NanoDrop 2000分光光度計對總RNA樣品質量濃度和純度進行檢測，結果顯示：RNA樣品量充足，OD260/OD280值在1.8～2.1之間。采用RT EasyTMⅡ試劑盒行逆轉錄合成cDNA。應用real-time PCR試劑盒檢測培養24、48、72 h的MG63細胞內OPG和RANKL的mRNA表達水平。引物序列見表1，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參照。

表 1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.2.6 統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，組間比較采用t檢驗，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 MT01/PEN復合物對MG63細胞上清液中OPG和RANKL蛋白表達的影響

MG63細胞上清液中OPG蛋白的表達水平見圖1。PEN組OPG蛋白表達水平在各時間點與空白對照組相比均無明顯差異（P＞0.05）。培養24 h時，MT01-s組、MT01/PEN復合物1∶4和1∶6組的OPG蛋白表達水平較高，明顯高于空白對照組（P＜0.01），而MT01/PEN復合物1∶4和1∶6組亦高于MT01-s組（P＜0.05）。培養48 h時，MT01-s組、MT01/PEN復合物1∶2組OPG蛋白表達水平較高，明顯高于空白對照組（P＜0.01）；培養72 h時，MT01/PEN復合物1∶6組的OPG蛋白表達量降低，低于空白對照組（P＜0.01）。

圖 1 轉染MG63細胞24、48、72 h后各組上清液中OPG蛋白的表達水平Fig 1 OPG protein expression levels of MG63 transfected for 24，48， 72 h in various groups

MG63細胞上清液中RANKL蛋白的表達水平見圖2。培養24 h時，MT01-s組和MT01/PEN復合物1∶6組的RANKL蛋白表達水平較空白對照組降低（P＜0.05），其中MT01/PEN復合物1∶6組明顯低于MT01-s組（P＜0.01）。培養48 h時，MT01/PEN復合物1∶2組的表達量降低，明顯低于空白對照組（P＜0.01）。培養72 h時，MT01組，MT01-s組，MT01/PEN復合物1∶2、1∶4、1∶6組的表達均低于空白對照組（P＜0.01），其中MT01/PEN復合物1∶2組低于MT01-s組（P＜0.05）。PEN組在各時間點的表達量均無明顯變化（P＞0.05）。

圖 2 轉染MG63細胞24、48、72 h后各組上清液中RANKL蛋白的表達水平Fig 2 RANKL protein expression levels of MG63 transfected for 24， 48， 72 h in various groups

將OPG/RANKL的比值進行比對，結果見圖3。24 h時，MT01組，MT01-s組，MT01/PEN復合物1∶4和1∶6組的OPG/RANKL值較空白對照組升高，其中MT01/PEN復合物1∶6組明顯高于MT01-s組（P＜0.05）。培養48 h和72 h時，MT01-s組、MT01/ PEN復合物1∶2和1∶4組OPG/RANKL值較空白對照組明顯升高，其中MT01/PEN復合物1∶2組在培養48 h時明顯高于MT01-s組（P＜0.05）。PEN組OPG/RANKL值在3個時間點均沒有明顯變化（P＞0.05）。

圖 3 各組OPG/RANKL值Fig 3 OPG/RANKL values in various groups

2.2 MT01/PEN復合物對MG63細胞內OPG和RANKL mRNA表達的影響

MG63細胞內OPG mRNA表達水平見圖4。與空白對照組和MT01-s組相比，MT01/PEN復合物1∶2、1∶4、1∶6組在培養48、72 h時，除1∶2組在48 h 的OPG mRNA表達水平低于MT01-s組外，其余組別均升高（P＜0.05），且隨復合物中PEN配比增高，OPG mRNA表達呈增強趨勢；而PEN組在各時間點與空白對照組比較均無明顯差異（P＞0.05）。

圖 4 轉染MG63細胞24、48、72 h后，細胞內OPG mRNA的表達水平Fig 4 OPG mRNA expression levels of MG63 transfected for 24，48， 72 h in various groups

MG63細胞內RANKL mRNA表達水平見圖5。

圖 5 轉染MG63細胞24、48、72 h后，細胞內RANKL mRNA的表達水平Fig 5 RANKL mRNA expression levels of MG63 transfected for 24， 48， 72 h in various groups

由圖5可見，在培養48 h時，與空白對照組和MT01-s組相比，MT01/PEN復合物1∶2組表達較低，而1∶4和1∶6組表達較高。在培養72 h時，MT01/ PEN復合物1∶2和1∶6組的表達量較空白對照組和MT01-s組降低（P＜0.05）。PEN組在各時間點與空白對照組的差異均無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

OPG是腫瘤壞死因子受體超家族成員，由成骨細胞分泌，作為可溶型誘餌受體，可競爭性地與RANKL結合［9-10］。RANKL是一種Ⅱ型跨膜蛋白，有可溶型和細胞膜整合型兩種形式，前者表達于成骨細胞或基質細胞，后者見于T細胞［11］。本實驗首先針對上清液中可溶型RANKL進行ELISA檢測，評價MG63細胞RANKL蛋白表達水平。成骨細胞所表達的OPG與RANKL的比值決定其對破骨前體細胞的誘導分化能力，其比例協調是維持骨代謝平衡的關鍵［12］。未成熟的成骨細胞主導破骨形成，RANKL與OPG的比值高，隨著成骨細胞的分化成熟，比值逐漸減小，而較成熟的成骨細胞擁有成骨表型，失去對破骨細胞的分化和激活作用［11，13］。本研究結果發現，PEN組中OPG和RANKL蛋白表達水平在3個培養時間點均無明顯變化，而隨著MT01/PEN復合物中載體PEN配比的增高，OPG/RANKL值出現變化的時間點提前，表明其促成骨作用依次增強。此外MT01-s也表現出了促進成骨的作用，這與本課題組前期研究［3］證實MT01具有促進成骨細胞分化的作用相一致。

為進一步證實在轉錄水平MT01/PEN復合物對MG63成骨作用的調控作用，本實驗通過real-time PCR方法檢測細胞內mRNA表達水平，結果表明，PEN組與空白對照組在mRNA表達水平上無明顯差異，而隨著復合物中PEN配比增高，OPG mRNA表達依次增強。另外本研究發現，兩種檢測方法的趨勢并非在所有時間點都完全吻合，原因在于OPG和RANKL在轉錄和翻譯的過程中，mRNA并不總是翻譯成蛋白質，蛋白質的出現也不一定意味著都具有生物學活性，兩者合成位置不同，且存在先后順序及化學修飾的影響，這種空間和時間上的差異不能忽略［14］。雖然48 h時，RANKL mRNA在個別組呈高表達，但其與相應組別的OPG mRAN表達趨勢相同，OPG/RANKL值仍較高，表明MG63細胞成骨作用增強。這與ELISA結果中表現出的趨勢相一致。在本課題組的前期實驗［8］中，已完成MT01/PEN復合物的轉染效率和細胞毒性的研究，結果發現，質量比為1∶6的MT01/PEN復合物的轉染效率最高，而細胞毒性相對較低，這可以解釋1∶6組首先出現OPG 和RANKL表達水平的明顯變化，而其他組別出現變化的時間相對較晚的現象。兩種不同的檢測手段分別在基因水平和蛋白質水平證實了MT01/PEN復合物對MG63細胞成骨作用的提高，且1∶6組對OPG 和RANKL的表達均產生了較強的影響。

本實驗通過對OPG和RANKL蛋白和基因表達水平的檢測，證實MT01通過與PEN構建傳輸體系可提高其對MG63細胞的促成骨作用。Tian等［7］利用N-異丙基丙烯酰胺通過Michael加成反應對PEI進行修飾，得到PEI衍生物PEN。PEN不僅保留了PEI原有的“質子海綿”效應［15］，同時提高了轉染效率，降低了細胞毒性，是一種理想的非病毒載體。應用PEN作為MT01載體，有助于實現MT01對細胞的高效轉染和特定功能表達，增強MT01促進成骨的作用。

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（本文編輯 吳愛華）

［中圖分類號］Q 51

［文獻標志碼］A ［doi］ 10.7518/hxkq.2016.01.007

［收稿日期］2015-08-25； ［修回日期］ 2015-11-13

［基金項目］白求恩前沿交叉學科創新基金（2013108031）

［作者簡介］崔野，碩士，E-mail：279914375@qq.com

［通信作者］孫新華，教授，學士，E-mail：xinhuasun8@163.com

Effect of MT01/PEN complexes on the expression of osteoprotegerin and receptor activator of nuclear factor κB ligandin human osteoblast-like cell line MG63

Cui Ye1，2， Zheng Yi3， Shen Yuqin3， Hou Xu1， Lou Yixin1， Sun Xinhua1.
（1. Dept. of Orthodontics， School and Hospital of Stomatology， Jilin University， Changchun 130021， China； 2. Jilin Provincial Key Laboratory of Tooth Development and Bone Remodel， Changchun 130021， China； 3. Dept. of Periodontology， School and Hospital of Stomatology， Jilin University， Changchun 130021， China）

Supported by: Bethune Frontier Interdisciplinary Innovation Foundation （2013108031）. Correspondence: Sun Xinhua， E-mail: xinhuasun8@163.com.

［Abstract］Objective This study aims to synthesize MT01 （a kind of oligodeoxynucleotides） and N-isopropylacrylamidemodified polyethylenimines （PEN） complexes （MT01/PEN） as well as to investigate the effect of the complexes on the expression of osteoprotegerin （OPG） and the receptor activator of nuclear factor κB ligand （RANKL） in the human osteoblast-like cell line MG63. Methods MG63 cells were transfected by MT01/PEN complexes formed with three different mass ratios （1∶2， 1∶4， 1∶6） of MT01 to PEN. MT01 and MT01-s were used as positive control. Enzyme-linked immunosorbent assay and real-time polymerase chain reaction were performed to estimate the amount of OPG and RANKL released into the culture media and in MG63 at 24， 48， 72 h. Results MG63 responded to the MT01/PEN complexes by significantly upregulating the OPG on the protein and mRNA levels （P＜0.05）. The protein and mRNA levels of RANKL were lower in most of the groups with complexes， and the OPG/RANKL ratio were higher （P＜0.05）. MG63 were affected by the MT01/PEN complexes with different mass ratios， particularly when the ratio was 1∶6. Conclusion MT01 can enhance the promotion of ossification by establishing the delivery system with PEN.

［Key words］human osteoblast-like cell line MG63； oligodeoxynucleotides MT01； N-isopropylacrylamide-modified polyethylenimines； osteoprotegerin； receptor activator of nuclear factor κB ligand