肉桂醛和百里香酚對生料工藝酒精發酵的影響

王欣，許宏賢，周鵬，段鋼

(杰能科(中國)生物工程有限公司，江蘇 無錫，214028)

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肉桂醛和百里香酚對生料工藝酒精發酵的影響

王欣，許宏賢，周鵬，段鋼*

(杰能科(中國)生物工程有限公司，江蘇 無錫，214028)

摘要肉桂醛和百里香酚具有較強的抑菌活性，常用于食品的保鮮和防腐，也可作為飼料添加劑。文中對肉桂醛和百里香酚對生料工藝酒精發酵的影響進行了研究。表明肉桂醛和百里香酚在酒精發酵中有一定的抑菌效果；以大米為原料時，10 μg/L的肉桂醛和50 μg/L的百里香酚使酒精產量分別提高了1.7%和0.7%；以玉米為原料時，50 μg/L的肉桂醛提高酒精產量2.0%，25 μg/L百里香酚提高1.43%；但如果繼續提高肉桂醛和百里香酚的濃度，會抑制酵母的生長，導致酒精產量降低。

關鍵詞肉桂醛；百里香酚；生料發酵；酒精

無蒸煮過程又稱生料制酒也稱一步發酵，是指在低于淀粉糊化的溫度下用生料淀粉水解酶與酵母共同作用于淀粉質原料產生酒精的過程。無蒸煮過程工藝已經在歐美國家得到了商業上的廣泛應用[1]，最有希望解決酒精生產中能耗高，效率低的問題。在酒精生產上，生料酶技術的使用，省去了高溫蒸煮過程，由于減少了淀粉在高溫時的損失，以及在生料酶的作用下系統中糖濃度很低，使得酵母產酒精的效率很高，因此淀粉轉化率大大提高[2]。但是，值得注意的是，生料酒精發酵是在無蒸煮的情況下進行，存在染菌的危險，這是必須考慮的因素之一。有研究表明，從酒精發酵中分離出的細菌有乳桿菌屬(Lactobacillus)、小球菌屬(Pediococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、醋桿菌屬(Acetobacter)、葡糖桿菌屬(Gluconobacter)和梭菌屬(Clostridium)等[3]，幾乎有2/3的所分離的細菌屬于乳酸細菌,例如乳桿菌[4]。最近幾年，DDGS中抗生素的殘留問題越來越得到重視，所以應在酒精生產中盡量避免使用抗生素。

安惠華TMEO是杜邦工業生物科技部丹尼斯克動物營養最新推出的一種經過細致平衡、內含高濃度百里香酚和肉桂醛的混合物，可作為飼料添加劑用于仔豬多發病飼養，而由于肉桂醛和百里香酚具有良好的抑制真菌的效果，也廣泛應用于食品加工和保存中的防腐保鮮，是中國、歐盟和美國都允許使用的食品添加劑。如果將安惠華TMEO應用到生料酒精生產中，能否達到抑制雜菌的生長，從而減少原料損失提高酒精產出，又能使安惠華TMEO在DDGS 中繼續發揮作用從而提高飼料的營養價值，本文對此進行了研究。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗原料

全磨大米粉(泰國)；全磨玉米粉(中糧豐原燃料酒精有限公司提供)；安琪牌釀酒高活性干酵母(耐高溫型)。

1.1.2主要酶制劑

高溫淀粉酶：SPEZYME ALPHA，杰能科國際公司，酶活力129 766 wu/g；糖化酶：GA-L-NEW，杰能科國際公司，酶活力100 000 wu/g；生料酶STARGEN 002，杰能科國際公司，酶活力570 GAU/g。

1.1.3主要試劑

TSA培養基：德國默克公司；尿素：國藥集團；無水乙醇、葡萄糖、麥芽糖、甘油、乳酸、乙酸均購自北京色譜中心，為色譜級。肉桂醛、百里香酚：國藥集團；Lactobacillusplantarum和Lactobacillusrhamnosus購自CICC菌種中心

1.2實驗設備

高壓液相色譜，Agilent 1200系列；恒溫循環器，賽默飛世爾科技(卡爾斯魯厄)公司；顯微鏡，BX53F,配DT2000 真彩色圖像分析系統；Quanta-2000電子顯微鏡，荷蘭FEI公司制造。

1.3分析方法

1.3.1發酵醪組成測定

高效液相色譜法，Agilent HP1200 高效液相色譜儀,HP Chemstations色譜工作站,色譜柱Bio-rad 87H。色譜分離操作條件(常溫下進行)流動相:0.005 mol/L H2SO4;流速 0.6 mL/min; 柱溫60 ℃; 進樣量20 μL。

1.3.2酵母數量的統計

血球計數法，取一定發酵液稀釋，滴1滴在血球計數板上，在顯微鏡下進行統計，以每個血球計數板中格中有30～80個酵母為宜。

2結果與討論

2.1安惠華TMEO101G 對乳桿菌的抑菌實驗

有研究表明，在酒精發酵過程染有的雜菌中幾乎2/3的為乳酸細菌，例如乳桿菌，故本文針對安惠華TMEO101G對乳桿菌的抑菌情況做了研究，取本實驗室的Lactobacillusplantarum和Lactobacillusrhamnosus培養于添加了不同濃度的安惠華TMEO101G液態培養基中，培養24 h后觀察，發現雖然安惠華TMEO101G的質量濃度在0.1～1 g/L時仍然有乳酸菌生長，但是其長勢逐漸減弱，并且在質量濃度達到1.5 g/L時，已經沒有乳桿菌生長。

表1　EO101G 對乳桿菌的抑制情況

2.2安惠華TMEO101G 對以大米為原料的生料發酵的影響

取一定量的全磨大米粉，以每個發酵三角瓶含100 g醪液計，加入33 g全磨大米和67 g自來水，加入安惠華TMEO101G，分別控制質量濃度在0.1，0.5,1和5 g/L，用26%的濃H2SO4調節pH為4.5左右，然后加入2.0 kg/MT 的生料酶STARGEN 002，600 μg/L的尿素和0.1%的干酵母粉，在32 ℃的水浴鍋中培養，培養70 h后取樣采用HPLC測定發酵醪的組成和酒精含量。

由圖1可以看出，在發酵前期安惠華TMEO101G的添加導致了22 h時酒精含量的降低，說明安惠華TMEO101G的添加造成了酒精發酵的延遲，但是隨著酒精發酵的進行，0.1～1 g/L的EO101G對酒精發酵的抑制作用減弱，反而在發酵結束時增加了最終的酒精含量，EO101G質量濃度在1.0 g/L時酒精產量達到了15.98%vol，比對照(15.60%vol)提高了2.43%。但是EO101G的質量濃度增加到5 g/L時，完全抑制了生料酒精發酵，在發酵結束時也沒有酒精的產生。

圖1　EO101G 對大米原料生料酒精發酵的影響Fig.1　The effect of EO101G on rice no-cooking process ethanol fermentation

2.3肉桂醛和百里香酚對大米生料發酵的影響

由于安惠華TMEO101G的有效成分主要為肉桂醛和百里香酚，故本文對肉桂醛和百里香酚分別對大米生料發酵的影響進行了研究，并且針對肉桂醛和百里香酚對發酵醪中酵母數量的影響進行了研究。

由圖2可以看出肉桂醛和百里香酚的添加減少了發酵醪中的酵母數量，并且隨著濃度的增加，發酵醪中的酵母數量逐漸降低，但這并沒有影響其發酵效率，數據表明質量肉桂醛質量濃度在10 μg/L時酒精產量達到了15.80%vol，比對照(15.53%vol)提高了1.7%，百里香酚質量濃度在50 μg/L時酒精產量達到了15.65%vol，比對照(15.53%vol)提高了0.7%。但是隨著肉桂醛和百里香酚濃度的繼續增加，最終酒精產量卻降低了，所以肉桂醛和百里香酚在低濃度可以促進酒精發酵提高酒精產量，但在高濃度時反而能抑制酒精發酵。

圖2　肉桂醛和百里香酚對大米原料的生料發酵的影響Fig.2　The effect of Cinnamaldehyde and Thymol on rice no-cooking process ethanol fermentation

2.4肉桂醛和百里香酚對玉米生料發酵的影響

取一定量的全磨玉米粉，以每個發酵三角瓶含100 g醪液計，加入33 g全磨玉米和67 g自來水，分別加入肉桂醛5，25和50 μg/L，百里香酚10，25，50和100 μg/L，用26%的濃H2SO4調節pH為4.5左右，然后加入2.0 kg/MT 的生料酶STARGEN 002，600 μg/L的尿素和0.1%的干酵母粉，在32 ℃的水浴鍋中培養，培養70 h后取樣用HPLC測定發酵醪的組成和酒精含量。由圖3可以看出，肉桂醛含量在5～50 μg/L時提高了最終酒精產量，在50 μg/L時酒精產量達到了14.30%vol，比對照(14.02%vol)提高了2.0%，百里香酚含量在10～25 μg/L時提高了最終酒精產量，在25 μg/L時酒精產量達到了14.22%vol，比對照提高了1.43%， 但是隨著肉桂醛和百里香酚質量濃度的繼續提高，最終酒精產量逐漸降低。

圖3　肉桂醛和百里香酚對玉米原料的生料發酵的影響Fig.3　The effect of Cinnamaldehyde and Thymol on corn no-cooking process ethanol fermentation

綜上所述, 在酒精生料發酵過程中分別添加肉桂醛或百里香酚或者添加二者的混合物，可以達到抑制雜菌的生長從而減少原料損失提高酒精產出的目的。考慮到肉桂醛和百里香酚在飼料中的作用，在酒精生料發酵過程添加這些物質提高了飼料的營養價值。

2.5肉桂醛和百里香酚對酵母細胞形態的影響

由于高濃度的肉桂醛和百里香酚在酒精生料發酵過程中能夠抑制酵母生長從而導致酒精產量降低，本文針對肉桂醛和百里香酚對酵母細胞形態的影響進行了研究。取一定量的干酵母溶解于100 mL自來水中，分別加入100 μg/L的肉桂醛和230 μg/L的百里香酚作用4 h之后，在江南大學進行掃描式電子顯微鏡觀測。由圖4可以看出，經過高濃度的肉桂醛和百里香酚處理的酵母細胞壁出現了褶皺型的畸形，BENNIS[5]在研究百里香酚和丁子香酚對酵母細胞壁的影響中也曾經報道過這種現象，并且汪琨[6]等人在研究中發現，肉桂醛特異性抑制真菌細胞壁葡聚糖和幾丁質的合成是其抑制真菌細胞生長的主要機制之一。

(a)對照；(b)100 μg/L肉桂醛作用4h；(c)230 μg/L百里香酚作用4h圖4　肉桂醛和百里香酚對酵母細胞形態的影響Fig.4　Scanning electronic microscope of S. cerevisiae

3討論

關于肉桂精油和百里香酚的抑菌作用機制的說法很多,趙丹[9]等人在研究中指出當肉桂精油作用于微生物菌體時,破壞了菌體的細胞膜結構,體內的一些重要離子(如K+和Na+)也隨之流出，導致細胞內部的多種生物酶不能正常合成,從而阻礙了細胞的代謝活動。此外,胞內離子對維持細胞內外滲透壓起到十分重要的作用,胞內離子流失則會影響內外滲透壓的調節,破壞細胞內環境的穩定性。而戴向榮[10]等人在研究中則表明肉桂醛能通過損傷黃曲霉細胞質膜而進入細胞，使胞內大分子空間結構改變并且有序的新陳代謝被破壞，導致抑制黃曲霉的生長。這些都驗證了肉桂精油通過先破壞菌體的表面結構,使其失去對周圍物質的選擇性,不能通透性地吸收和轉運,當濃度達到一定程度時殺死了菌體,菌株生長則被完全抑制。

關于抑菌劑對酒精發酵的研究有很多，研究最多的就是乙酸和乳酸等抑菌劑對酒精發酵的影響[7]，如TARA GRAVES[8]在研究中就指出乙酸和乳酸在低濃度時能夠提高酒精產量，減少酵母數量，但是隨著濃度增加酒精產量也逐漸降低，這跟肉桂醛和百里香酚對生料酒精發酵的影響十分相似，酵母數量雖然減少，但是其發酵效率并不減弱，酵母數量過多反而生產效率降低，酵母數量減少，節省了產生RNA,DNA,蛋白質等的NADPH， 酵母可以有更多的能量去生產酒精，當然對于低濃度肉桂醛和百里香酚對酒精發酵的促進作用還需要進一步進行研究。

參考文獻

[1]王年忠,趙二永,王芳,等，陳化小麥生料酒精發酵的中試[J].食品與發酵工業,2013,39(4):81-85

[2]段鋼, 許宏賢, 孫長平,等.乙醇生產的技術進步—新型酶技術給乙醇生料發酵生產帶來的突破[J] 食品與發酵工業,2006,32(7):65-70

[3]胡里奧.皮門特爾. 控制乙醇生產中的細菌生物膜[P].CN103930554A

[4]SKINNER K A,LEATHERS T D.Bacterial contaminants of fuel ethanol production[J].Ind Microbiol Biotech, 2004,31:401-408

[5]BENNIS S,CHAMI F,CHAMI N,et al.Surface alteration of Saccharomyces cerevisiae induced by thymol and eugenol[J]. Letters in Applied Microbiology, 2004,38(6): 454-458.

[6]汪琨, 徐崢, 汪倩雯,等.肉桂醛特異性抑制酵母細胞壁合成的作用機理[J].食品與發酵工業, 2012,38(3): 68-72.

[7]DEREK A,ABBOTT WM.Ingledew buffering capacity of whole corn mash alters concentrations of organicacids required to inhibit growth ofSaccharomycescerevisiaeand ethanolproduction[J] Biotechnology Letters,2004,26:1 313-1 316.

[8]TARA G,NEELAKANTAM V,NARENDRANATH K. Effect of pH and lactic or acetic acid on ethanol productivitybySaccharomycescerevisiaein corn mash[J] Ind Microbiol Biotechnol,2006,33: 469-474.

[9]趙丹,孫旸,陳光.肉桂精油抑菌作用的研究[J].長春:吉林農業大學學報,2013:1-3.

[10]戴向榮,蔣立科,羅曼.肉桂醛抑制黃曲霉機理初探[J].食品科學,2008,29(1):36-40

The effect of cinnamaldehyde and thymol on no-cookprocess ethanol fermentation

WANG Xin,XU Hong-xian,ZHOU Peng,DUAN Gang*

(Genercor (China) Bio-product Co. Ltd, Wuxi 214028, China)

ABSTRACTCinnamaldehyde and Thymol have anti-microbial activity, usually used as preservative in food processing and feed additive in poultry and piglet diets. The effect of cinnamaldehyde and thymol on no-cook process ethanol production was studied. The result showed that when using rice as raw material additional cinnamaldehyde at 10ppm orthymol at 50ppm resulted in 1.7% and 0.7% ethanol yield increasing respectively; similarwith rice, when using corn as raw material, 50 ppm cinnamaldehyde and 25ppm thymolresulted in 2.0% and 1.43% ethanol yield increasing respectively; However, if further increasing concentration of cinnamaldehyde and thymol,yeast growth was inhibited and ethanol yield was decreased.

Key wordscinnamaldehyde; thymol; no-cook process; ethanol

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606017

收稿日期：2016-01-27，改回日期：2016-03-15

第一作者：碩士(段鋼博士為通訊作者，E-mail:gang.duan@dupont,com)。