賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)釀酒酵母的分離及其主要特性研究

高曉航，李雪雁，孫春麗

(蘭州理工大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州，730050)

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賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)釀酒酵母的分離及其主要特性研究

高曉航，李雪雁*，孫春麗

(蘭州理工大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州，730050)

摘要為進一步豐富我國釀酒酵母資源，從賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)的6個不同品種的成熟期釀酒葡萄果實上分離獲得9株野生釀酒酵母，以商業(yè)釀酒酵母F15為對照，對分離所得菌株分別進行酒精、SO2、葡萄糖、pH和高滲等耐受性以及β-葡萄糖苷酶活力和果糖利用率影響因素的研究。結果表明，菌株B-1比較適合用于釀造葡萄酒，且β-葡萄糖苷酶主要存在于釀酒酵母細胞外；釀酒酵母的PFK及HK的活性與果糖利用率無相關關系。

關鍵詞釀酒酵母；耐受性；β-葡萄糖苷酶；磷酸果糖激酶；己糖激酶；果糖利用率

釀酒酵母作為葡萄酒發(fā)酵過程中最重要的生產(chǎn)菌，直接影響葡萄酒的質量，因此選用適宜的酵母菌對葡萄酒品質尤為重要[1]。β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase)作為水解葡萄糖苷的關鍵酶，能將葡萄中的非揮發(fā)性糖苷轉化成揮發(fā)性物質，提高葡萄酒香氣復雜性，改善葡萄酒質量[2]，因此，酵母菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力的高低也是其釀酒性能非常重要的特性之一。果糖是葡萄中主要的糖分之一，在葡萄酒釀造過程中，酵母菌會首先分解轉化葡萄糖，后分解果糖。有研究表明，發(fā)酵中后期葡萄酒中的低葡萄糖果糖比是導致發(fā)酵緩慢或停滯的一個重要因素，若果糖不能被有效利用而殘留在葡萄酒中，會造成葡萄酒口感失衡，且酒中殘?zhí)沁€會誘發(fā)微生物污染。影響果糖利用的因素可能與磷酸果糖激酶(Phosphofructokinase, PFK)、己糖激酶(Hexokinase, HK)和轉運蛋白有關。

本研究為進一步豐富我國釀酒酵母資源，擬從賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)分離出較優(yōu)的野生釀酒酵母，對其進行耐受性以及β-葡萄糖苷酶的研究，以篩選出適合葡萄酒釀造的菌株，并通過測定分離所得野生釀酒酵母的果糖利用率、PFK和HK酶活力，來研究這2種酶的活力與果糖利用率之間的關系。

1材料與方法

1.1材料與試劑

試樣：采自于寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)的6種成熟期釀酒葡萄果粒，分別為：赤霞珠，西拉，梅鹿輒，霞多麗，蛇龍珠和黑比諾。

商業(yè)釀酒酵母菌株F15(Saccharomycescerevisiae)：由蘭州理工大學生命科學實驗教學示范中心提供。

葡萄汁培養(yǎng)基：鮮榨葡萄汁(10 BX)，瓊脂2%，pH 5.0，1×105Pa滅菌20 min；

YPD培養(yǎng)基：酵母浸膏1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%(固體培養(yǎng)基添加瓊脂2.0%)，pH 5.0，1×105Pa滅菌20 min；

果糖培養(yǎng)基：酵母浸膏1.0%，蛋白胨2.0%，果糖2.0%，1×105Pa滅菌20 min；

WL營養(yǎng)培養(yǎng)基：酵母浸粉0.4%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖5%，瓊脂2%，儲液A(KH2PO45.5g，KCl 4.25 g，CaCl21.25 g，MgSO41.25 g，定容至400 mL，按1/25比例添加)，儲液B(FeCl30.25 g，MnSO40.25 g，定容至100 mL，按1/1000比例添加)，儲液C(0.44 g溴甲酚綠溶于100 mL 50%乙醇溶液中，按0.1%比例添加)，1×105Pa滅菌20 min。

L-谷胱甘肽(還原型谷胱甘肽)(BR)，Triton x-100(RT)，北京博奧拓達科技有限公司；對硝基苯酚(pNP)(AR)，天津市凱信化學工業(yè)有限公司；咪唑(AR)，天津市大茂化學試劑廠；對硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)(BR),南京都萊生物技術有限公司；PFK(磷酸果糖激酶)試劑盒，HK(己糖激酶)試劑盒,蘇州科銘生物技術有限公司；半胱氨酸鹽酸鹽(BR)，咔唑(CP),上海中秦化學試劑有限公司。

1.2儀器及設備

SW-CJ-1FD型超凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；FA2004型分析天平，上海良平儀器儀表有限公司；DSX-280A型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；UV-3000PC型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；TGL-16型高速冷凍離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1野生釀酒酵母菌株的分離與鑒定

分別從6種成熟整穗葡萄中各摘取優(yōu)質葡萄50粒，無菌條件破碎后常溫放置1 h，各取葡萄汁0.1 mL涂布于葡萄汁培養(yǎng)基上，重復3次，28 ℃培養(yǎng)2 d后，將長出的菌落接種YPD固體培養(yǎng)基上，再次28 ℃培養(yǎng)2 d，將再次長出菌落轉接到YPD固體培養(yǎng)基上，劃線分離，純化菌株至純種。通過形態(tài)學鑒定，將從自然發(fā)酵醪中分離出的野生酵母菌轉接至WL營養(yǎng)培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，28℃培養(yǎng)5～10 d，觀察菌落顏色和形態(tài)，進一步進行分類鑒定。

1.3.2酵母菌株的耐受性試驗

以菌株F15作為對照，將篩選出的酵母菌等量(用無菌水配成每毫升含108個細胞數(shù)的懸浮液)分別接種于乙醇體積分數(shù)(6%、9%、12%、15%、18% vol)、SO2質量濃度(50、100、150、200、250、300 mg/L)、葡萄糖含量(5%、10%、15%、20%、25%、30%)、pH(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0)、NaCl質量濃度(60、80、100、120、140、160 g/L)的帶杜氏小管的YPD液體培養(yǎng)基(10 mL)試管中，28 ℃培養(yǎng)72 h，觀察每支試管中的杜氏小管內(nèi)是否產(chǎn)生氣泡，并記錄產(chǎn)生氣泡的時間及氣泡體積的變化，若產(chǎn)生氣泡則耐受該條件，同等條件相同時間氣泡體積越大則對該條件耐受性越強。

1.3.3釀酒酵母β-葡萄糖苷酶活性的測定

不同種類酵母菌的β-葡萄糖苷酶在酵母中的分布不同，以菌株F15為對照，測定9株野生釀酒酵母的胞外、壁膜間隙和細胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶的酶活性，酵母菌的β-葡萄糖苷酶是由這3部分酶相加所得。

β-葡萄糖苷酶活性的測定：采用以對硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷為酶底物的比色法[3]。β-葡萄糖苷酶的酶活力表示為每小時1 g干重細胞反應生成的對硝基苯酚的量(μmol)。采用王彩肖等[2]的方法制作pNP標準曲線，得方程y=0.008 7x+0.005 0(R2=0.999 4)。

1.3.4果糖利用率的研究

1.3.4.1果糖利用率的測定

采用半胱氨酸-咔唑比色法[5]。采用張曉卿等[5]的方法制作果糖標準曲線，得方程y=0.019 99x+0.01348(R2=0.999 3)。

1.3.4.2磷酸果糖激酶活性的測定

按照PFK試劑盒使用說明書進行操作。酶活力單位的定義：1 g干重細胞1 min催化1 nmol果糖-6-磷酸和1 nmol ATP轉化為1 nmol果糖-1,6-二磷酸和1 nmol ADP定義為1個酶活力單位。

1.3.4.3己糖激酶活性的測定

按照HK試劑盒使用說明書進行操作。酶活力單位的定義：1 g干重細胞1 min生成1 nmol NADPH定義為1個酶活力單位。

2結果與分析

2.1野生釀酒酵母菌株的分離與鑒定

從6個不同品種成熟期釀酒葡萄的自然發(fā)酵醪中分離出117株酵母菌，通過WL培養(yǎng)基篩選出9株釀酒酵母，分別編號為2-1、2-2、2-3、2-4、A-2、A-5、A-7、A-8和B-1。

2.2釀酒酵母菌株的耐受性分析

2.2.1酒精耐受性

復篩所得9株野生釀酒酵母和對照菌株F15的不同最大耐乙醇體積分數(shù)(見圖1)比較可知，9株釀酒酵母酒精耐受能力均低于對照菌株。菌株2-3和菌株B-1酒精耐受能力為12%，基本滿足釀造葡萄酒的要求，但應用于實際生產(chǎn)還需進一步馴化培育。

圖1　不同釀酒酵母的酒精耐受性結果比較Fig.1　Comparison of alcohol tolerance of different S.cerevisiae

2.2.2SO2耐受性

復篩所得9株野生釀酒酵母與對照菌株F15的不同最大耐SO2濃度(見圖2)比較表明，菌株B-1耐SO2能力與對照菌株F15相當，可耐受300 mg/L SO2。根據(jù)國標GB2760—2011《食品安全國家標準—食品添加劑使用標準》要求葡萄酒中SO2最大使用量250 mg/L，說明菌株B-1完全適應葡萄酒釀造的SO2環(huán)境。

圖2　不同釀酒酵母的SO2耐受性結果比較Fig.2　Comparison of SO2 tolerance of different S.cerevisiae

2.2.3高糖耐受性

隨著葡萄糖質量濃度的升高，杜氏小管內(nèi)出現(xiàn)氣體的時間略有延長。復篩所得9株野生釀酒酵母與對照菌株F15的不同最大耐糖濃度(見圖3)比較發(fā)現(xiàn)，菌株B-1耐高糖能力與對照菌株相當，葡萄酒釀造過程中釀酒酵母接觸的最高糖度一般在30%左右，菌株2-3所能耐受的葡萄糖質量濃度為25%左右，所以菌株B-1和2-3對高糖的耐受性基本能適應葡萄酒釀造的糖度環(huán)境。

圖3　不同釀酒酵母的高糖耐受性結果比較Fig.3　Comparison of high glucose tolerance of different S.cerevisiae

2.2.4低pH耐受性

隨著pH的降低，杜氏小管內(nèi)產(chǎn)氣時間延長，產(chǎn)氣量減少。由圖4可知，菌株B-1對pH的耐受性相比對照菌株略差，當pH降至2.5時，杜氏小管內(nèi)沒有氣體產(chǎn)生，菌株B-1不能生長。與張翠英等[7]報道的釀酒酵母最低生長pH 2.5相比，耐受性略低。一般葡萄汁或葡萄酒pH在3～4，說明菌株B-1和2-3能滿足葡萄酒釀造的pH環(huán)境。

圖4　不同釀酒酵母的低pH耐受性結果比較Fig.4　Comparison of pH tolerance of different S.cerevisiae

2.2.5滲透壓耐受性

隨著NaCl質量濃度的升高，杜氏小管內(nèi)氣體量遞減。由圖5可知，菌株B-1對NaCl的耐受性高于對照菌株，菌株B-1在NaCl質量濃度為120 g/L的YPD培養(yǎng)基中仍能生長，高于蔣錫龍等[8]報道的釀酒酵母耐KCl滲透壓1.8 mol/L，比薛軍俠等[9]報道的個別釀酒酵母耐受2.4 mol/L的KCl低，菌株B-1耐滲透脅迫能力較強，說明菌株B-1完全適應葡萄酒釀造的滲透壓環(huán)境。菌株2-2耐滲透脅迫能力與對照組相當，說明該菌株也能適應葡萄酒釀造的滲透壓環(huán)境。

圖5　不同釀酒酵母的滲透壓耐受性結果比較Fig.5　Comparison of osmoticsterss tolerance of different S.cerevisiae

2.3β-葡萄糖苷酶活性的比較

通過比較不同釀酒酵母的β-葡萄糖苷酶酶活力(見表1)可知，所試釀酒酵母的β-葡萄糖苷酶主要分布在細胞外，除對照菌株F15外，菌株2-1的β-葡萄糖苷酶活性最高，為175.215 μmolpNP/(g·h)，酶活高于110.00 μmolpNP/(g·h)的菌株還有B-1、A-8、A-5和A-2。菌株2-1胞外酶活最高，為136.799 μmolpNP/(g·h)。結合表1可知，不同野生釀酒酵母發(fā)酵上清液中的β-葡萄糖苷酶活性差異顯著(P<0.05)。

2.4果糖利用率的研究

2.4.1果糖利用率的測定

由表2可知，商業(yè)酵母F15的果糖利用率最高，接近于100%，復篩所得菌株果糖利用率由高到低依次為A-2、2-3、A-7、A-5、A-8、B-1、2-4、2-2和2-1，不同菌株之間果糖利用率差異顯著。

表1　不同釀酒酵母的β-葡萄糖苷酶酶活力

注：數(shù)據(jù)后標注不同小寫字母表示多重比較差異顯著(P<0.05)，下同。

表2　不同釀酒酵母的PFK與HK酶活力以及果糖利用率

2.4.2PFK及HK酶活性的比較

由表2可知，菌株2-3的PFK酶活性最高，對照菌株F15最低，不同釀酒酵母之間PFK酶活性差異顯著。菌株2-3的HK酶活性最高，菌株A-2最低，不同菌株之間HK酶活性差異顯著。

3結論

本試驗通過從寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)的6種成熟期釀酒葡萄果粒分離獲得了9株野生釀酒酵母，通過對這9株釀酒酵母進行耐受性分析以及β-葡萄糖苷酶活力的測定，得知釀酒酵母β-葡萄糖苷酶主要位于細胞外，除對照菌株F15外，酶活性高于110.00 μmol pNP/(g·h)的菌株依次是2-1、B-1、A-8、A-5和A-2。綜合分析，菌株B-1耐受性各項指標均能滿足釀造葡萄酒的基本要求，且β-葡萄糖苷酶活性也較高。通過對各菌株果糖利用率、PFK和HK酶活力的測定和比較，結果表明釀酒酵母的PFK及HK的活性與果糖利用率無相關關系。

目前，國內(nèi)外有關釀酒酵母果糖利用率的研究報道較少，本試驗從PFK和HK兩個酶的酶活性著手研究，補充了當前釀酒酵母果糖利用率的研究空白，結果證明了PFK和HK酶活性與釀酒酵母果糖利用率無相關關系。因此，為進一步探索影響釀酒酵母果糖利用率的機理，還需從其他可能的影響因子上進行更深一步的研究。

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The isolation and main characteristics ofSaccharomycescerevisiaein East Helan mountain wine-producing regions

GAO Xiao-hang, LI Xue-yan*, SUN Chun-li

(School of life science and engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China)

ABSTRACTIn order to further enrich the resources of wild Saccharomyces cerevisiae in China, 9 yeast strains were isolated from 6 different varieties of mature wine grape fruits in East Helan mountain wine-producing areas. The tolerance (alcohol, SO2, glucose, pH and high osmotic pressure, etc.), β-glucosidase enzyme activity and fructose utilization of the 9 wild wine yeasts were studied using the commercial strain F15 as control. The results showed that the strain B-1 was suitable for brewing wine, and the β-glucosidase mainly existed in the extracellular fluid of S.cerevisiae. The activity of PFK and HK in S.cerevisiae was not correlated with the utilization of fructose.

Key wordsSaccharomyces cerevisiae; tolerance; β-glucosidase; phosphofructokinase; hexokinase; fructose utilization rate

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606011

收稿日期：2016-01-07，改回日期：2016-02-18

第一作者：碩士研究生(李雪雁教授為通訊作者,E-mail：llglixueyan@163.com)。