艾滋病熱毒蘊結證的miRNA差異表達研究

姜　岑,曹春輝,李白雪,馮全生△

(1.成都中醫藥大學基礎醫學院　610075;2.重慶市中醫院　400011)

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艾滋病熱毒蘊結證的miRNA差異表達研究

姜岑1,曹春輝2,李白雪1,馮全生1△

(1.成都中醫藥大學基礎醫學院610075;2.重慶市中醫院400011)

[摘要]目的研究艾滋病(AIDS)熱毒蘊結證患者與健康對照組間miRNA表達差異。方法運用Agilent miRNA芯片對AIDS期熱毒蘊結證患者與健康對照組血液標本進行miRNA檢測，采用SAS等系統對組間差異miRNA進行篩選，并對相應的miRNA進行靶基因預測和靶基因功能顯著性分析。結果熱毒蘊結證組與健康對照組比較，共篩選出表達有顯著性差異且倍數差異(FC)大于2的miRNA 100條，其中64條上調，36條下調。差異表達miRNAs功能涉及T細胞活化中的IL-21受體的作用、C反應蛋白、免疫效應的過程中的正調控等。結論AIDS熱毒蘊結證患者與健康對照組間存在差異miRNA表達，其證候生物學基礎可能與T細胞活化中的IL-21受體的作用等相關。

[關鍵詞]獲得性免疫缺陷綜合征；熱毒蘊結證；miRNA；靶基因

艾滋病(AIDS)是感染人免疫缺陷病毒(HIV)引起的一種嚴重威脅人類健康的致死性傳染病，目前人類還沒有完全治愈此病的方法，我國醫學在防治AIDS方面具有一定的優勢與特色。隨著中醫藥防治AIDS臨床及科研工作的不斷深入，很多亟待解決的問題已逐漸顯現出來。提升中醫藥防治AIDS水平，辨證是關鍵，所以建立客觀化、標準化的艾滋病中醫證候診療體系具有重要意義。miRNA是非編碼小分子RNA，在基因轉錄后過程中起重要調節作用[1]。本文引入基因芯片技術研究AIDS中醫典型證候，篩選AIDS期熱毒蘊結證患者差異表達的miRNA，本文為進一步探討AIDS中醫證候的生物學基礎，為AIDS的中醫證候研究提供客觀依據。

1資料與方法

1.1一般資料本研究的病例來自于臨床上符合納入標準和排除標準的AIDS期患者，本研究納入熱毒蘊結證患者25例，健康對照受試者8例。其中，西醫診斷標準參考2011版《艾滋病診療指南》，中醫診斷標準參考2004版《中醫藥治療艾滋病臨床技術方案(試行)》。納入標準：(1)符合西醫診斷標準和中醫辨證標準者；(2)年齡大于18歲且小于65歲；(3)自愿參加本研究，簽署知情同意書者。符合以上所有條件者，才能納入本研究。排除標準：(1)孕婦及哺乳期患者；(2)合并惡性腫瘤患者；(3)神志不清、癡呆、各種精神病患者及家屬不愿意合作者；(4)合并乙型、丙型病毒性肝炎等慢性肝病患者；(5)原發性免疫缺陷，激素化療等引起的繼發性免疫缺陷，血液病，其他原因引起的中樞神經系統疾病；非感染HIV所患的臟器嚴重疾病;(6)研究者認為不適合納入研究的患者,以上有一項是“是”者，排除觀察。

1.2方法根據診斷標準、納入標準、排除標準納入符合要求的病例。其中AIDS熱毒蘊結證組25例、健康對照組8例。采集AIDS患者和健康對照組血液標本，-80 ℃低溫保存，干冰密封保存，送往生物芯片公司，進行Agilent基因芯片的檢測，并采用SAS差異性分析系統篩選差異表達miRNA的篩選，并對差異性miRNA進行靶基因功能顯著性分析。

1.3統計學處理采用SAS系統篩選兩組間的差異表達miRNA，用Targetscan等數據庫進行差異表達miRNA靶基因預測，并在SAS系統中進行靶基因功能顯著性分析(GO分析)。

2結果

2.1熱毒蘊結證組與健康對照組差異miRNA熱毒蘊結證組與健康對照組比較，共篩選出表達有顯著性差異(P<0.05)且倍數差異(fold chang，FC)大于2的miRNA 100條，其中64條上調，36條下調，見圖1。

2.2AIDS期熱毒蘊結證組差異miRNA分析將篩選出有顯著性差異miRNA進行靶基因預測，再用SAS系統對差異表達miRNA進行功能顯著性分析(GO分析)。AIDS期熱毒蘊結證組的差異表達顯著性miRNAs靶基因預測,共篩選出靶基因5 536條，其中上調miRNA共篩選出3 620條靶基因，下調miRNA共篩選出1 916條靶基因。然后將篩選出的靶基因進行功能顯著性分析(P<0.05)，結果發現這些基因功能主要涉及：T細胞活化IL-21受體的作用，C反應蛋白(CRP)，免疫效應過程中的正調控，氧化應激，血小板，對病毒的防御反應，干細胞分裂，分解代謝過程，水解酶活性，RNA聚合酶，補體激活，脂質運輸，信號傳導，T細胞介導的細胞毒性等，見圖2。

圖1　兩組差異表達的miRNA火山圖

圖2　兩組差異miRNA GO 分析(主要)

3討論

本研究選擇外周血漿中的miRNA，主要原因是miRNA和免疫系統關系十分密切，大量研究表明：(1)miRNA廣泛參與免疫細胞的增殖、分化、免疫應答和免疫性疾病調控，同時與病毒感染關系密切[2-3]；(2)AIDS實質上是免疫系統疾病，其感染人體及致病與免疫系統密切相關；(3)前期研究表明，如Pegtel等[4]發現外周血中的miRNA可能是細胞主動合成，而并非靶細胞凋亡后被動釋放出來；Chen等[5]發現哺乳動物外周血清、血漿中存在含量和理化性質穩定的miRNA，即提取外周血中的miRNA操作簡便可靠。故本研究選擇外周血漿中的miRNA具有理論和實踐基礎。

熱毒蘊結證篩選出的差異miRNA靶基因功能主要有以下方面：氧化應激，血小板，CRP，T細胞活化IL-21受體的作用，免疫效應的過程中的正調控，信號傳導、脂代謝等。

CRP是肝臟合成的一種急性時相反應蛋白。在創傷、感染、炎癥反應等情況下，血漿CRP水平迅速升高。余豐等[6]研究了CRP水平與HIV/AIDS患者抗病毒治療及預后的關系，CRP在HIV/AIDS患者中高表達，與疾病進展呈正相關。在HIV/AIDS病程中，血小板減少主要與HIV對骨髓巨細胞的損害、抗血小板生成抑制、抗體形成等有關[7]，臨床上，可出現迫血妄行，發斑發疹，苔黃脈數等表現，與血小板減少癥狀相符。眾多研究證實，HIV感染者體內處于慢性氧化應激狀態，表現為HIV的復制能力增強，免疫細胞的增生減少，甚至喪失免疫功能。同時，HIV可誘導細胞凋亡與對藥物毒性的敏感性增加[8]。韓曉群等[9]發現HIV/AIDS患者機體氧化還原態越偏向氧化方向，標志著AIDS患者病情的進展。IL-21是近來發現的具有免疫調節作用的細胞因子，研究表明[10]，HIV感染中，IL-21可增強CD8+T細胞上粒溶素和穿孔素表達，增強NK細胞的毒性和抗體依賴細胞介導的細胞毒性作用，其可增加它們抗病毒能力，且不會引起免疫細胞的活化。

研究發現，在AIDS期熱毒蘊結證患者篩選出的差異miRNA中，Has-miR -126通過參與體內脂代謝的調控，影響動脈粥樣硬化的發展進程[11]，其通過調控PI3K/Akt通路來調節T淋巴細胞的免疫活性和功能[12]。Has-Let-7f能抑制記憶T細胞中IL-23的表達，但Has-Let-7f在記憶性T細胞的內源性表達和幼稚T細胞中相比顯著偏低[13]。

綜上所述，AIDS期熱毒蘊結證患者與健康人的體內存在著差異表達的miRNA譜，其證候生物學基礎可能是與T細胞活化中的IL-21受體的作用，CRP、血小板、氧化應激等相關。

參考文獻

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Research of miRNA differential expression of AIDS with the syndrome of heat-toxic accumulation

Jiang Cen1,Cao Chunhui2,Li Baixue1,Feng Quansheng1△

(1.SchoolofBasicMedicine,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu,Sichuan610075,China;2.ChongqingHospitalofTraditionalChineseMedicine,Chongqing400011,China)

[Abstract]ObjectiveThe Study the difference of miRNA expression of AIDS patients with toxic heat accumulation syndrome with healthy control group.MethodsThis research used Agilent miRNA chip to test the miRNA of blood preparation,and used SAS system to screen the differences between groups,then analyzed the significance function of target gene.ResultsCompare the heat-toxic accumulation group and the healthy control group,100 cases of obvious expression difference and of which the difference was 2 times and greater were screened out (in which 64 cases showed up-regulation and 36 showed down-regulation).Differentially expressed miRNAs function involves the role of IL-21 receptor in T cell activation,C reactive protein,and the positive regulation of the immune response.ConclusionAIDS toxic heat accumulation syndrome patients and healthy control groups exist differences in miRNA expression profiles,the biological basis of syndrome maybe related to T cell activation and IL-21 receptor.

[Key words]AIDS;heat-toxic accumulation;miRNA;target gene

作者簡介：姜岑(1987-),講師，博士，主要從事中西醫結合與復方配伍研究。△通訊作者，Tel:13688120528；E-mail:fengqs@163.com。

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.020

[中圖分類號]R512.91

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)17-2365-02

(收稿日期：2015-12-18修回日期：2016-03-11)