兩種奶牛結核病檢測方法的比較研究

孫建文　達劍森

摘要：牛結核病是由牛分枝桿菌引起的一種人獸共患的慢性消耗性傳染病，嚴重威脅著人類的健康。因此，對該病的定期檢疫對公共衛生和食品安全具有重大意義。本研究采用提純結核菌素（PPD）皮內變態反應試驗和y-干擾素（IFN-y）ELISA試驗，對揚州市的892頭奶牛進行結核病檢測。結果表明，PPD皮內變態反應檢出的31頭牛型結核陽性牛和可疑牛中，經IFN-yELISA試驗檢測僅檢出9頭禽型結核可疑牛。PPD皮內變態反應試驗特異性較差，出現了較高的假陽性率，其原因可能與禽結核分枝桿菌感染或其他非特異性因素的干擾有關。

關鍵詞：結核病；結核菌素；y-干擾素；酶聯免疫吸附測定

牛結核病（Bovinetuberculo-sis，BTB），是由牛結核分枝桿菌（M.bovis）引起的一種人和多種家畜共患的慢性傳染病，以組織器官的結節性肉芽腫和干酪樣、鈣化的壞死病灶為特征。在家畜中，以奶牛最為易感，其次為水牛、黃牛和牦牛。農業部將其列為二類動物疫病，衛生部將其列為乙類人間傳染病。世界動物衛生組織（OIE）將其列為法定報告動物疫病。PPD皮內變態反應試驗是OIE規定的金標準，在普查牛結核病中廣泛使用，但其特異性較低，日常檢測中假陽性率較高。近年來，IFN-yELISA試驗以其高特異性和靈敏度的優勢，受到廣大業內人士的關注。本研究旨在通過比較PPD皮內變態反應法和IFN-yELISA方法在檢測奶牛結核病時的優缺點，為確定快速準確的奶牛結核病診斷方法提供參考，同時也為今后開展揚州市奶牛結核病的流行病學調查提供技術支撐。

1.材料與方法

1.1試驗動物

奶牛抗凝血樣品來自2013-2015年度揚州市某區兩個奶牛場，檢測對象為兩場全部青壯年牛和成年奶牛，3年合計檢測數為892頭（3年分別為272頭、296頭和324頭）。

1.2試劑

牛型提純結核菌素（為黑龍江省生物制品一廠產品）；游標卡尺（0～150mm）（為上海量具刀具廠產品）。生化培養箱（HWS-250，為上海森信實驗儀器有限公司產品）；生物安全柜（BSC-1500ⅡA2-X，為濟南鑫貝生物技術有限公司產品），酶標儀（RT-6000，為深圳雷杜生命科學股份有限公司產品），IFN-y檢測試劑盒（BovigamTM）（為PrionicsAG公司產品），刺激原禽型提純結核菌素（PPD-A）和牛型提純結核菌素（PPD-B）（均為瑞士Prionics公司產品）。

1.3方法

1.3.1PPD皮內變態反應

根據動物結核病診斷技術（GB/T18645-2002），用牛結核菌素0.1mL注射于牛的頸中部（左側或右側），分別于72h和120h進行兩次觀察，觀察局部有無熱腫脹痛的炎性反應，并量取皮皺厚度得出皮厚差。結果判定：以皮厚差大于4mm為陽性，2～4mm為可疑，小于2mm為陰性。凡檢測為可疑的牛于檢測后60d進行復檢，復檢后仍為可疑的牛判為陽性。

1.3.2IFN-yELISA試驗

PPD皮內變態反應檢測結果為陽性或可疑的牛，在30d后采抗凝血5mL，無菌條件下將抗凝血加入24孔細胞培養板（每份樣品作3孔重復，1.5mL/孔）；對應孔中分別加入100uL無菌PBS（作陰性對照）、刺激原禽型提純結核菌素和牛型提純結核菌素，抗原與分裝的血液充分混勻后振蕩1min，以上操作在采血后6h內進行；將加樣完畢后的細胞培養板在37℃培養箱中孵育過夜（24h）；收集上清（不少于300uL）-20℃貯存待檢。

使用IFN-y檢測試劑盒對樣品進行檢測，方法參照試劑盒說明書操作。

2.結果與分析

2.1PPD皮內變態反應檢測結果

3年間用PPD皮內變態反應共檢測兩個奶牛場樣本892頭，結核陽性和疑似的奶牛為31頭（次），檢測結果見表1，陰性牛數據未列出。

由表1可知：2013年兩個奶牛場第1次檢測有9頭牛判定為結核陽性，其中A場有4頭，B場有5頭；有4頭牛判定為可疑，其中A場有3頭，B場有1頭。然后對這4頭牛進行了嚴格的隔離，相隔60d后進行了復檢。復檢由同一人操作，采用同樣材料和方法，結果表明：這4頭牛復檢皮厚差均小于2mm，判定為陰性。

2014年兩個奶牛場第1次檢測有3頭牛判定為結核陽性，其中A場有1頭，B場有2頭；有13頭牛判定為可疑，其中A場有7頭，B場有6頭。隔離60d后復檢，結果表明：13頭可疑牛中，有5條牛判定為可疑；有8頭牛判定為陰性。

2015年兩個奶牛場第1次檢測有1頭牛判定為結核陽性，屬A場；有1頭牛判定為可疑，屬B場，隔離60d后復檢，結果為陰性。

通過連續3年的監測，發現A場PPD皮內變態反應檢測結果陽性數分別為4、4、1頭，其陽性率分別為2.56%、2.38%、0.55%；B場逐年監測的陽性數分別為5、4、0頭，陽性率分別為4.31%、3.13%、0。兩個奶牛場3年來陽性率分別為3.31%、2.70%、0.31%，結果呈現逐年下降趨勢。

2.2IFN-YELISA檢測結果

對初檢PPD檢測結果為陽性或可疑的31頭奶牛的抗凝血經IFN-YELISA試驗檢測，結果均為陰性。但其中有9頭牛禽型結核分枝桿菌檢測結果為可疑。

2.3兩次皮內變態反應與IFN-Y誘導試驗檢測結果的比較

表2數據說明，兩個奶牛場3年來PPD皮內變態反應檢測結果假陽性率較高，筆者推測結果可能受到禽型結核分枝桿菌感染或其他非特異性因素干擾。

3.討論

PPD皮內變態反應是國際貿易的診斷準，也是在全球范圍內用于牛結核病檢疫和凈化應用最為廣泛的方法。該方法的優點在于試劑成本較低，適于在基層廣泛使用；但同時又因其過程耗時較長、影響因素較多、60d內復檢陽性率降低等缺點，其檢測結果易受某些病原感染、治療藥物、人為誤差、個體差異等較多因素影響，結果常出現一定比例的假陽性、假陰性，無法保證其敏感性、特異性和準確性。尤其是對于可疑病例，檢測工作量更大，耗時更長，在基層奶牛結核病凈化工作中的弊端日益顯現，若單獨用該方法，對檢出的陽性牛即實行“檢疫-撲殺”策略，會誤殺一些假陽性牛，一定程度上會造成較大的經濟損失。

本試驗對892頭奶牛使用PPD皮內變態反應和IFN-yELISA方法進行了對比檢測，從結果可以看出，PPD方法非特異性較強，出現較多的假陽性/假陰性結果。2013-2015年來對揚州市某區的2個奶牛場通過PPD皮內變態反應進行初檢，用IFN-yELISA試驗對陽性牛和可疑牛進行復檢，PPD皮內變態反應結果（13/892）與IFN-yELISA試驗結果（0/31）的吻合度較差，與文獻報道結果一致。從本試驗數據可看出，有9頭牛的檢測結果可能與其受到禽型結核分枝桿菌感染有關。另外，在復檢前對牛群進行了驅蟲，結果陽性數下降，其原因可能與受寄生蟲感染等非特異性因素干擾有關。

IFN-yyELISA方法操作簡單快捷、敏感性好、特異性強，減少了人為誤差，處于感染早期的牛也可檢出，并且可以有效區分牛、禽型結核分枝桿菌以及假陽性牛，在奶牛結核病的檢測和凈化工作中可發揮重要作用。但是，目前將該方法進行大規模推廣還存在一些困難，主要是因為進口試劑盒價格昂貴，檢疫成本較高，樣品前處理較為繁瑣。本試驗證明臨床牛結核病的診斷可采取兩種方法相結合的方式，利用IFN-yELISA方法對PPD皮內變態反應陽性牛和可疑的奶牛進行確診檢測，可以有效的排除禽結核的干擾，提高檢測準確性，避免出現誤殺。

綜上所述，與PPD皮內變態反應相比，IFN-yELISA檢測方法特異性較好，在實際檢測過程中能夠節省大量的時間，因此，在進行牛結核病檢測時，可先采用PPD皮內變態反應進行篩查，檢出陽性即采取隔離；然后采用y-干擾素ELISA檢測方法進行綜合判斷，二者檢測均為陽性的牛應立即予以淘汰，這樣經過數輪檢測淘汰，既可避免誤殺、錯殺，又可盡快達到凈化牛結核病的目的。（編輯：趙曉松）