酒精發酵過程中脅迫因子對酵母海藻糖積累的影響

許宏賢，周　鵬，王　欣，張曉萍，段　鋼（杜邦工業生物應用科技部杰能科（中國）生物工程有限公司，江蘇無錫214028）

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酒精發酵過程中脅迫因子對酵母海藻糖積累的影響

許宏賢，周鵬，王欣，張曉萍，段鋼
（杜邦工業生物應用科技部杰能科（中國）生物工程有限公司，江蘇無錫214028）

摘要：針對酒精生產酵母可能面臨的受迫性因子對海藻糖形成的影響進行了研究。結果表明，不同碳源如蔗糖、葡萄糖對酒精發酵液中海藻糖的含量幾乎沒有差別；黃曲霉毒素Afb1對酒精發酵海藻糖的累積有一定的影響；發酵起始pH值過高（6.5）或過低（3.5）都會導致發酵液中游離海藻糖含量/海藻糖總量增高，發酵起始pH值過低（3.5）還會導致酵母胞內海藻糖含量升高；發酵溫度過高（38℃）會導致發酵液中游離海藻糖/胞內海藻糖/海藻糖總量升高；氮源不足會引起發酵液中海藻糖/胞內海藻糖/海藻糖總量顯著升高，并且氮源對胞內海藻糖累積的影響遠遠大于溫度。

關鍵詞：海藻糖；碳源；pH值；毒素；溫度；氮源；酒精

海藻糖是由2個吡喃型葡萄糖通過α，α-1，1-糖苷鍵連接而成的雙糖，是一種穩定的非還原性雙糖，廣泛存在于藻類、細菌、真菌、酵母、昆蟲等動植物和微生物中。它既是一種貯藏性糖類，又是生物體抵御脅迫環境的應激代謝物，特性非常穩定，能夠在高滲、高溫、高寒、干燥失水等惡劣的條件下于細胞表面形成特殊的保護膜，有效地保護生物分子結構不被破壞，從而維持生命體的生命過程和生物特征。

目前已知的微生物體內生物合成海藻糖的途徑有3種［1］，見圖1。其中OtsAB是酵母菌和大腸桿菌抵御脅迫環境最常規的合成途徑。從UDP-葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸形成海藻糖-6-磷酸，之后經去磷酸化形成游離的海藻糖。該反應由海藻糖-6-磷酸合成酶（OtsA）和海藻糖-6-磷酸磷酸酶（OtsB）分別催化。

圖1　　海藻糖在細菌體內生物合成途徑

濃醪發酵是酒精生產的發展方向［2］。在高濃度發酵初期，高濃度底物（如葡萄糖）及后期逐漸積累的乙醇會對細胞產生毒害作用，影響發酵。海藻糖作為酵母受脅迫的指標性物質之一，國內外對其研究持續不斷。早在1998年，史戈峰等［3］的研究就表明，當起始葡萄糖濃度達到24%，發酵時間為65～70 h時，酵母細胞內海藻糖可高達細胞干重的20%；喬長晟等［4］研究表明，加壓有利于酵母菌胞內海藻糖質量分數的積累，并且酵母菌株應激產物海藻糖積累越高，其越有利于適應體外環境劇烈的改變，相應的酵母菌株對壓力的敏感性越強，加壓導致酵母菌形態變化越明顯，反應體系中pH值降低是影響酵母菌活性的主要因素，由此可認為，高壓條件下的CO2酸化作用是影響面包酵母海藻糖生成的主要因素。丁春磊［5］2014年研究了不同質量的原材料如粉狀木薯、黃木薯、正常塊狀木薯，在發酵過程中，由于在一定程度上受到木薯原料質量影響，導致微生物發酵產生有害因子，對酵母代謝產生抑制作用，海藻糖含量增高。Hottiger等［6］的研究表明，熱刺激可導致酵母大量積累海藻糖；Hounsa等［7］于1998年研究了滲透壓對海藻糖積累的影響；Mahmud等［8-14］及眾多學者研究了鹽的因素對酵母積累海藻糖的影響。這些對酵母積累海藻糖抵抗惡劣環境作用及作用機理的研究有助于酒精工業的發展，然而工業化酒精生產過程中，酵母的受脅迫因子遠不止于此，常見的因素匯總如圖2［15］。由此可見除了醪液濃度、壓力、原材料質量、溫度、離子濃度之外，還有很多因素都會使酵母處于極端環境。為此本研究針對酒精生產酵母可能面臨的受迫性因子如不同碳源、黃曲霉毒素、pH值、溫度和氮源對海藻糖形成的影響進行了研究。

圖2　　酵母所受脅迫性因子

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與培養基

釀酒高活性干酵母（耐高溫型）：安琪酵母公司。

酒精發酵培養基（g/L）：碳源，葡萄糖200（或根據試驗要求調節）；氮源，蛋白胨20，酵母粉10（或根據試驗要求調節），pH5.5（根據試驗要求調節）。

1.1.2實驗材料

黃曲霉毒素標準品Afb1購于sigma；蛋白胨、酵母粉購于Oxford公司；葡萄糖、蔗糖、三氯乙酸等其他試劑均購于國藥集團，木薯粉由國內某酒精廠提供；酶制劑SPEZYME ALPHA、DISTILLASE POWERSACC由杰能科（中國）生物工程有限公司提供。

1.1.3實驗設備

ICS-5000型離子色譜，Dionex公司；高效液相色譜（1260型），Agilent公司；電子天平，梅特勒公司；離心機、水浴鍋，賽默飛世爾科技公司。

1.2實驗方法

1.2.1酒精發酵

取適量干酵母，加入適量無菌水，配制成1 g/L，室溫活化20 min。每個250 mL三角瓶中裝入150 mL培養基，加入活化酵母后32℃（或根據試驗要求調節）靜置發酵一定時間，發酵液用于分析。

1.2.2胞內海藻糖的提取

取一定體積的發酵液，在12000 r/ min條件下離心10 min，將沉淀的酵母細胞用蒸餾水洗滌3次，離心后用三氯乙酸萃取。

1.2.3海藻糖的測定

采用離子色譜測定發酵液及胞內海藻糖含量。Dionex，ICS-500型離子色譜。包括在線脫氣裝置的四元梯度泵GP50、電化學檢測器ED50，Au為工作電極，Ag/ AgCl為參比電極，脈沖安培檢測器工作參數E1 = 0.1V，t1 = 400 ms；E2 = 2V，t2 = 20 ms；E3 = 0.6V，t3 = 10 ms；E4 = 0.1V，t4 = 70 ms。CarboPakTM PA200色譜柱，流動相100 mmol/L NaOH，流速0.5 mL/min，柱溫30℃，進樣量25 μL。

1.2.4發酵液的分析

采用HPLC測定發酵液的組成成分。取0.5 mL發酵上清液，0.005 mol/L稀硫酸稀釋10倍，過0.22 μm膜，Agilent 1260型HPLC，Bio-Rad Aminex HPX-87H色譜柱，進樣量20 μL，流動相0.005 mol/L稀硫酸，流速0.6 mL/min，柱溫60℃；示差檢測器。

2結果與討論

2.1不同碳源（蔗糖、葡萄糖）對海藻糖形成的影響

蔗糖是酒精工業中使用范圍僅次于葡萄糖的碳源，為此選取葡萄糖和蔗糖，分別配制不同濃度的培養基（100 g/L或200 g/L），離子色譜分析酒精發酵液中游離海藻糖的含量，結果見表1。

表1　不同碳源（蔗糖、葡萄糖）對海藻糖形成的影響

由表1可知，蔗糖、葡萄糖對酒精發酵液中海藻糖的形成的影響幾乎沒有差別，這大概是由于兩者都是酵母可利用的碳源，并且濃度都沒有達到使酵母受脅迫的程度所致。

2.2毒素（黃曲霉毒素Afb1）對海藻糖形成的影響（葡萄糖為底物）

黃曲霉毒素是陳化糧中最常見的毒素之一。近年來我國糧食年年豐收，某些地區出現相對過剩，庫存量不斷上升，由于氣候、儲存條件限制等種種原因，導致部分糧食受微生物污染，發霉變質，毒素水平超標從而無法食用，只能用于燃料乙醇生產。為此我們研究了毒素（黃曲霉毒素Afb1）對發酵液中游離海藻糖含量的影響，同時測定酵母胞內海藻糖含量，結果見表2。

表2　毒素（黃曲霉毒素Afb1）對海藻糖形成的影響

由表2可知，黃曲霉毒素Afb1對酒精發酵海藻糖形成有一定的影響，隨著黃曲霉毒素Afb1升高，發酵液中的海藻糖（胞外）和酵母胞內的海藻糖含量都呈現出升高的趨勢，毫無疑問黃曲霉毒素是酵母受迫性因素之一，酵母細胞通過調節自身海藻糖的合成來抵御它的傷害。

2.3發酵起始pH值對海藻糖形成的影響（葡萄糖為底物）

在酒精生產企業中［16］，由于傳統、廣泛使用的源自黑曲霉的糖化酶的最佳pH值為4.2～4.5，乳酸菌的生長在pH值低于5.0的情況下會受到抑制，這兩方面因素使得絕大多數酒精廠在液化后通過加入硫酸調節發酵起始pH值，通?？刂圃?.0左右，有時為了控制或預防染菌，甚至會在3.5左右。為此我們研究了發酵起始pH值對酒精發酵和海藻糖形成的影響，用HPLC對發酵液成分進行分析，結果見表3；同時采用離子色譜分析酒精發酵液中游離海藻糖含量和酵母細胞內海藻糖含量，結果見表4。

由表3的HPLC結果來看，過低的起始pH值（3.5）會導致整個過程中反應體系的pH值都比較低，殘余葡萄糖含量升高，發酵遲緩，最終酒度降低，另一個受迫性指標甘油的含量也隨之上升。由表4可知，發酵起始pH值對酒精發酵海藻糖的形成有一定影響，發酵起始pH值過高（6.5）或過低（3.5）都會導致發酵液中游離海藻糖含量/海藻糖總量增高，發酵起始pH值過低（3.5）還會導致酵母胞內海藻糖含量升高，因此綜合來看，酵母酒精發酵控制起始pH4.5～5.5比較合適。

表3　發酵不同起始pH值對發酵液成分的影響

2.4溫度和氮源對海藻糖形成的影響（葡萄糖為底物）

高溫是公認的導致酵母分泌積累海藻糖的主要因素之一，但是到目前為止鮮有氮源對酵母分泌積累海藻糖影響的報道，然而在濃醪發酵過程中，氮源無疑是酵母最主要的受迫性因素之一［17］，為此我們耦合溫度這一因素，對不同氮源濃度對海藻糖形成的影響進行了研究。HPLC發酵液成分分析結果見表5，發酵過程中發酵液中游離海藻糖含量、胞內海藻糖含量、菌體量、發酵液海藻糖總量分別見圖3—圖6。

表5　發酵溫度和不同氮源濃度對發酵液成分的影響（葡萄糖為底物）

圖3　葡萄糖為底物溫度和氮源對游離海藻糖的影響

由表5可知，氮源不足或發酵溫度過高都會導致殘余葡萄糖大幅增高，酒精度下降；圖3揭示了發酵過程中海藻糖含量隨溫度和氮源濃度的不同而發生的變化，由此可見充足的氮源和適當的發酵溫度是保證發酵液中游離海藻糖能夠充分下降的必要條件；圖4揭示了發酵過程中酵母胞內海藻糖的變化過程，氮源不足會導致發酵結束時胞內海藻糖含量大幅度增加，并且看起來氮源對胞內海藻糖累積的影響遠遠大于溫度，這是始料未及的結果；圖5揭示了發酵過程中菌體量的變化，高溫會導致菌體量大幅度減少；圖6表征了溫度和氮源對總的海藻糖含量的影響，若想海藻糖維持在較低水平，溫度和氮源都必須符合酵母的要求，任何一個條件不滿足都會導致最終總的海藻糖含量大幅度升高；比較圖6和圖3可知，總海藻糖量的變化趨勢與游離海藻糖量的接近。

圖4　葡萄糖為底物溫度和氮源對胞內海藻糖的影響

圖5　葡萄糖為底物溫度和氮源對菌體量的影響

圖6　葡萄糖為底物溫度和氮源對總的海藻糖含量的影響

高熱環境在許多方面危及細胞，最主要的是造成膜的不完整以及使得蛋白質變性與凝結。細胞暴露在高熱中造成蛋白質凝結，最終死亡。Mike［18］以及其他學者［19-20］認為海藻糖在酵母細胞遭受熱沖擊時起了穩定蛋白的作用。最近又發現海藻糖也能抑制變性蛋白的凝結，維持他們的部分折疊狀態，在此狀態下，蛋白質可被分子伴隨物重新激活，但是海藻糖的繼續存在將影響蛋白的重新折疊。筆者推測氮源不足導致的胞內海藻糖大幅度累積也許與此有關。

酵母體內除了存在與海藻糖生物合成有關的海藻糖-6-磷酸合成酶（OtsA）和海藻糖-6-磷酸磷酸酶（OtsB）之外，還存在中性海藻糖酶（NTH）和酸性海藻糖酶（ATH）［21］。NTH的pH值活性范圍在6.7～7.0；ATH的pH值在4.0～5.0；ATH和NTH在酵母的生命周期顯示相反的活力模式。NTH的活性在酵母的指數生長期高，而當細胞進入呼吸和穩定期時迅速衰減；與此相反，ATH的活性僅在細胞進入呼吸或/和穩定期或生長在呼吸底物如乙醇或甘油上時才能檢出。因此，ATH活性對應的酵母生命周期是其產物、海藻糖已經累積到相當可觀的水平的階段；而NTH僅在指數生長期即海藻糖水平很低時有活性。酵母的不同生命階段這兩個海藻糖酶是如何進行功能協調的尚不為人知。但毫無疑問酵母體內海藻糖合成酶系的活力變化和海藻糖酶系的活力變化共同導致了發酵期間游離海藻糖、胞內海藻糖含量的變化。

2.5溫度和氮源對海藻糖形成的影響（木薯粉為底物）

鑒于2.4的研究是用葡萄糖做底物，而實際生產多采用淀粉質原料邊糖化邊發酵工藝，故采用淀粉質原料中蛋白質含量相對較少的木薯粉進行驗證，具體的實驗條件為：木薯粉漿濃度30%，pH值調節5.6，液化酶SPEZYME ALPHA，添加量0.2 kg/MT；85℃維持120 min；液化結束后不調節pH值，冷卻至室溫添加糖化酶DISTILLASE POWERSACC，添加量0.8 kg/MT；氮源采用不同濃度的尿素，接入酵母后在不同溫度下進行發酵。HPLC發酵液分析結果見表6，發酵過程中發酵液中游離海藻糖含量的變化見圖7。

表6　發酵溫度和不同氮源濃度對發酵液成分的影響（木薯粉為底物）

比較表5和表6可知，采用木薯粉作原料得到了和葡萄糖做原料類似的結果，氮源不足或溫度過高都會導致殘余葡萄糖大幅增高，酒度下降；比較圖3和圖7可知，與葡萄糖為原料相一致，充足的氮源和適當的發酵溫度是保證發酵液中游離海藻糖含量能夠充分下降的必要條件；發酵過程中游離海藻糖的變化木薯粉原料和葡萄糖原料不完全一致，筆者認為這是由于原料不同，導致酵母體內海藻糖合成酶系的活力和海藻糖酶系的活力有所不同所致。

圖7　木薯粉為底物溫度和氮源對游離海藻糖的影響

3　展望

高濃度發酵近年來成為發酵工業的重要研究方向之一。過去十幾年美國酒精業已經完成了從普通發酵（12%vol～15%vol）到濃醪發酵（16%vol～19%vol）的轉型［22］。酵母在濃醪條件下的受脅迫因子更具挑戰性。海藻糖是酵母受脅迫的指標性物質之一，由于外源性的海藻糖酶可以把發酵液中的游離海藻糖水解成葡萄糖從而被酵母利用提高酒精產出，故發酵液中海藻糖含量的研究對進一步提高酒精發酵水平具有指導意義。

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中圖分類號：TS262.2；TS261.1；TS261.4

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）05-0065-05

收稿日期：2016-02-23； 2016-04-01

作者簡介：許宏賢（1970-）女，江蘇無錫人，工學碩士，高級研究員，主要從事食品與發酵的研究，E-mail：sophia.xu@dupont.com。

通訊作者：段鋼（1966-），男，遼寧沈陽人，工學博士，亞太地區技術總監，主要從事工業酶應用與開發，E-mail：gang.duan@dupont.com。優先數字出版時間：2016-04-06；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160406.1454.001.html。

DOI：10.13746/j.njkj.2016060

Effects of Stress Factors on Trehalose Accumulation in the Process of Ethanol Fermentation

XU Hongxian，ZHOU Peng，WANG Xin，ZHANG Xiaoping and DUAN Gang
（DuPont Industrial Biosciences，Genencor（China）Bio-product Co. Ltd.，Wuxi，Jiangsu 214028，China）

Abstract：The effects of stress factors on trehalose accumulation in the process of ethanol fermentation were explored. The results showed that，there was almost no difference in the effects of different carbon sources such as glucose and sucrose on the content of trehalose；there was a little effects of aflatoxin Afb1 on trehalose accumulation；extreme pH values，such as too high pH（6.5）or too low pH（3.5），would lead to higher in vitro trehalose and total trehalose in the fermentation broth，while too low pH（3.5）might also lead to higher in vivo trehalose；higher fermentation temperature（38℃）might result in higher trehalose content both in vitro and in vivo（which meant higher total trehalose accumulation）；insufficient nitrogen source might lead to remarkable higher in vitro/ in vivo/total trehalose accumulation（reported for the first time），and it seemed that nitrogen source played a more important role than temperature.

Key words：trehalose；carbon source；pH；aflatoxin；temperature；nitrogen source；ethanol