寒痹丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

崔恩忠，陳美惠，貢　磊，盛　華，湯　淏

?

·論著·

寒痹丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

崔恩忠，陳美惠，貢磊，盛華，湯淏

目的建立寒痹丸的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法對方中當(dāng)歸和川芎進(jìn)行薄層色譜鑒別,同時采用HPLC法對淫羊藿中淫羊藿苷進(jìn)行含量測定。結(jié)果薄層色譜中斑點(diǎn)清晰，專屬性強(qiáng)；淫羊藿苷在10.15～81.20g/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為99.92%(RSD=1.34%)。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)所用方法簡便，重現(xiàn)性良好，定量方法準(zhǔn)確可靠，可用于寒痹丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制。

寒痹丸；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜；高效液相色譜法

寒痹丸為南京軍區(qū)南京總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科所研制，經(jīng)臨床應(yīng)用多年，療效確切。原方由細(xì)辛、黃芪、當(dāng)歸、土鱉蟲、制川烏、制草烏、川芎、淫羊藿和雞血藤等九味中藥飲片組成，具有散寒止痛，活血通絡(luò)之功效，用于治療風(fēng)濕與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎及其他寒濕痹證型關(guān)節(jié)疼痛。本實(shí)驗(yàn)對方中當(dāng)歸和川芎進(jìn)行薄層色譜鑒別,同時采用HPLC法對淫羊藿中淫羊藿苷進(jìn)行含量測定，進(jìn)一步完善了其質(zhì)量控制方法，為評價并建立其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)依據(jù)。

1　儀器與藥材

Waters高效液相色譜儀(1525型雙泵+2487型紫外檢測器，美國Waters公司)；梅特勒爾AH-240電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；UV-1700紫外分析儀(日本島津)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)。

對照藥材當(dāng)歸(120927-201014)、川芎(120918-201110)和淫羊藿苷(110737-200415)均購自中國藥品生物制品檢定所；寒痹丸均為南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科配制(樣品1批號140822，樣品2批號141019，樣品3批號141213)；本實(shí)驗(yàn)所用中藥飲片均購自安徽亳州；薄層層析硅膠G(薄層色譜用，青島海洋化工)；乙腈(色譜純，美國天地產(chǎn)品)，其余所用試劑均為分析純。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1當(dāng)歸、川芎的鑒別對照藥材溶液的制備：取當(dāng)歸、川芎對照藥材各0.5 g，同法制成對照藥材溶液。

供試品溶液的制備：取本品4 g，研細(xì)，加乙醇25 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，溶液轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶內(nèi)，作為供試品溶液。

陰性對照溶液的制備：按處方比例稱取除當(dāng)歸、川芎以外的其余藥材，研碎，按本品制備工藝及供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。

照薄層色譜法試驗(yàn)：吸取供試品溶液、對照藥材溶液及陰性對照溶液各20 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(9∶1)為展開劑，展開后取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。

2.2淫羊藿苷的含量測定色譜條件：色譜柱：Hedera-ODS-2 C18柱(4.6×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(29∶71)；檢測波長：270 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10L。理論塔板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)算應(yīng)不低于1500。

對照品儲備液的制備：精密稱取淫羊藿苷對照品8.12 mg，置于100 mL量瓶中，加稀乙醇至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。

對照品應(yīng)用液的制備：精密稱取對照品儲備液3.5 mL，置10 mL量瓶中，加稀乙醇至刻度，搖勻，作為對照品應(yīng)用液。

供試品溶液的制備：取本品粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)60 min放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，續(xù)取濾液，即得。

陰性對照溶液的制備：按處方比例稱取除淫羊藿以外的其余藥材，按本品制備工藝及供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。

方法專屬性考察：精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10L，在上述色譜條件下進(jìn)樣檢測。

線性關(guān)系考察：精密吸取淫羊藿苷儲備液1.25、2.5、5.0、7.5、10.0 mL分別至10 mL量瓶中，用稀乙醇溶液稀釋至刻度，可得10.15、20.30、40.60、60.90、81.20g/mL等一系列濃度。精密吸取10L在上述色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，以對照品濃度為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行回歸分析，計(jì)算回歸方程。

重復(fù)性試驗(yàn)：取寒痹丸(批號120315)，按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，分別在上述色譜條件下進(jìn)樣測定，以峰面積計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

加樣回收率試驗(yàn)：稱取已知含量的樣品0.25 g(批號為120315)，共 9份，置于50 mL錐形瓶中，分別精密加入淫羊藿苷對照品儲備液8.0 mL、10.0 mL和12.0 mL，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液。精密吸取上述供試品溶液各10L注入色譜儀，測定含量，計(jì)算回收率。

3　結(jié)　果

3.1當(dāng)歸、川芎的鑒別按照2.1項(xiàng)下的薄層色譜鑒別方法進(jìn)行鑒定。如圖1所示，供試品在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，同時陰性對照無此斑點(diǎn)，證明處方中其他藥材對當(dāng)歸和川芎的鑒別無干擾。在制劑有效期內(nèi)，該鑒別均呈正反應(yīng)。取三批不同批號的樣品依法檢驗(yàn)，結(jié)果均滿意。

1. 樣品1(140822); 2. 樣品2(141019); 3. 樣品3(141213);4. 當(dāng)歸對照藥材; 5. 川芎對照藥材; 6. 陰性對照圖1　當(dāng)歸、川芎的薄層色譜圖譜

3.2含量測定

3.2.1淫羊藿苷的含量測定方法專屬性考察：供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的保留時間處，有同一色譜峰，而陰性對照溶液在相應(yīng)保留時間處則無峰出現(xiàn)，表明其對樣品測定無干擾。結(jié)果見圖2。

A:淫羊藿苷對照品;B:寒痹丸樣品;C:陰性圖2　專屬性試驗(yàn)

淫羊藿苷線性關(guān)系考察：按2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，以對照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程：Y=21762974X-7950，r=0.9999。結(jié)果表明，淫羊藿苷的濃度在10.15～81.20g/mL之間，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：按2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，以淫羊藿苷峰面積計(jì)算，RSD為0.29%。結(jié)果表明該方法的精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：按2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，以淫羊藿苷峰面積計(jì)算，RSD為1.09%。結(jié)果表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：按2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，計(jì)算峰面積的RSD為0.71%。結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收率試驗(yàn)：按2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行計(jì)算測定，平均回收率為99.92%，RSD為1.34%。結(jié)果見表1。

表1　淫羊藿苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

3.2.2樣品含量測定取10批寒痹丸，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果見表2。

參考10批樣品測定結(jié)果以及淫羊藿苷的轉(zhuǎn)移率，確定本品每g含淫羊藿苷以淫羊藿苷計(jì)不得少于1.0 mg。

表2　10批樣品含量測定結(jié)果

4　討　論

4.1薄層色譜鑒別項(xiàng)的選擇當(dāng)歸含揮發(fā)油及水溶性成分，水溶性成分有阿魏酸、煙酸、丁二酸、膽堿等[2-4]；川芎含揮發(fā)油及生物堿類、酚類等[5-7]；兩者成分非常相似，無法排除陰性干擾，故薄層色譜鑒別陰性對照采用雙缺味，本方法具有專屬性。

4.2含量測定最大波長的選擇：精密稱取一定量的對照品于50 mL量瓶中，加稀乙醇溶液定容，進(jìn)行紫外掃描，測得最大吸收波長為270 nm。

流動相的選擇：參照《中國藥典》2015版一部淫羊藿中淫羊藿苷的含量測定方法，流動相為乙腈-水(30∶70)時寒痹丸陰性樣品有干擾。參考相關(guān)文獻(xiàn)[8-12]后調(diào)整流動相為乙腈-水(29∶71)后，陰性樣品無干擾，且分離度較好。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2]王兆惠,程自銀.不同產(chǎn)地當(dāng)歸揮發(fā)油的成分研究.藥物生物技術(shù),2013,20(6):535-537.

[3]張慶,茹慶國,林紅梅，等.基于PLSR分析當(dāng)歸揮發(fā)油分子蒸餾餾分中化學(xué)成分與抗炎作用的相關(guān)性.環(huán)球中醫(yī)藥,2015,8(10):1153-1158.

[4]李 濤,何璇.GC-MS測定野生當(dāng)歸揮發(fā)油中的化學(xué)成分.藥華西藥學(xué)雜志,2015,30(2):249-250.

[5]胡春蘭,楊冬麗,張東閣，等.兩種方法提取川芎揮發(fā)油指紋圖譜的對比.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2015,21(5):88-91.

[6]劉曉芬,連艷,高必興.不同方法提取川芎揮發(fā)油的GS-MS分析.中藥與臨床,2014,5(3):17-19.

[7]徐曉芳,孫東東,李祥，等.川芎水提部位化學(xué)成分的UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2013,29(4):382-386.

[8]王閏,孟慧,許 勇.復(fù)方甘草軟膏的制備及含量測定法的建立.東南國防醫(yī)藥,2015,17(4):389-392.

[9]于淼,原源.HPLC法測定益心酮片中四種黃酮類成分的含量. 東南國防醫(yī)藥,2015,17(2):157-165.

[10]李穎.淫羊藿HPLC指紋圖譜的建立與產(chǎn)地、部位成分差異性研究.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,14(2):177-178.

[11]王玲,尹華,李清林，等.高效液相色譜法測定補(bǔ)腎活血藥對淫羊藿-川芎中阿魏酸和淫羊藿苷的含量.湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2013,15(5):33-36.

[12]羅曼.HPLC法測定復(fù)方杜仲口服液中淫羊藿苷的不確定度評價.中國藥事,2010,24(1):88-91.

(本文編輯：張仲書；英文編輯：王建東)

Study onquality standard of Hanbi Pill

CUI En-zhong, CHEN Mei-hui,GONG Lei, SHENG Hua, TANG Hao.

DepartmentofPharmaceution,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,PLA,Nanjing,Jiangsu210002,China

ObjectiveTo establishthe quality standard of Hanbi Pill. MethodsA TLC method was used for qualitative identification of the Radix Angelicae Sinensi and the Ligusticum chuanxiong Hort, and the Icariin was determined by HPLC. ResultsThe TLC spots were clear, with strong specificity. The linear relationship of Icariin content was good in the range of 10.15-81.20g/mL, and the average recovery was 99.92% (RSD=1.34%). ConclusionThe method is simple, accurate and reliable, with good reproducibility, and it can be used for the quality control of Hanbi Pill.

Hanbi Pill; quality; TLC; HPLC

全國醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高科研專項(xiàng)課題面上課題(14ZJZ16-3)

210002江蘇南京,南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科

湯淏，E-mail：tanghao_0518@sina.com

R927.11

A

10.3969/j.issn.1672-271X.2016.03.018

2016-01-19；

2016-03-01)

引用格式：崔恩忠，陳美惠，貢磊,等.寒痹丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究.東南國防醫(yī)藥，2016,18(3):281-283,297.