基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜用于產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌ST11分型的研究

李曉紅，丁進(jìn)亞，劉　杰，公彥文，薛文成，趙　斌

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·論著·

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜用于產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌ST11分型的研究

李曉紅1，丁進(jìn)亞2，劉杰3，公彥文4，薛文成5，趙斌6

目的探討基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)用于產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌ST11分型。方法收集2012年10月-2014年10月5所醫(yī)院的80株產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌菌株。經(jīng)多位點(diǎn)序列分析(MLST)，28株為ST11型，52株為其他分型(other sequence type, OST)。通過MSP dendrogram聚類分析、MALDI Biotyper建立數(shù)據(jù)庫、ClinPro Tools建立模型3種方法研究ST11分型的可能性。結(jié)果MSP dendrogram聚類分析在距離水平線1000處可將80株菌聚類分析為兩類，敏感性為65.78%，特異性為92.85%。MALDI Biotyper數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證結(jié)果：18株ST11有1株菌分為OST，32株OST有2株菌被分為ST11，敏感性為89.47%，特異性為96.77%。ClinPro Tools用其余菌株驗(yàn)證模型全部正確，敏感性和特異性均為100%。結(jié)論MALDI-TOF MS可通過3種方法區(qū)別ST11與OST，以ClinPro Tools軟件建立模型的方法最可靠。

ST11型；肺炎克雷伯菌；碳青霉烯酶；MALDI-TOF MS

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院感染常見的病原菌，其多重耐藥菌株增加了抗感染治療的難度。為防止其在院內(nèi)形成暴發(fā)流行，建立對其快速監(jiān)測和分型的方法有重要意義[1-2]。脈沖場凝膠電泳和多位點(diǎn)序列分析(MLST)是常用的肺炎克雷伯菌分型方法，但均耗時(shí)、費(fèi)力且價(jià)格昂貴[3-4]。基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)是新近發(fā)展的簡便、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的病原微生物鑒定方法[5-6]。本文旨在探討MALDI-TOF MS用于產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌ST11分型的可能性。

1　材料與方法

1.1菌株來源收集2012年10月-2014年10月沈陽、北京、武漢、濟(jì)南等地5所醫(yī)院分離出的80株產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌，其中28株為ST11型，52株為其他分型。所有菌株改良Hodge試驗(yàn)均為陽性。

1.2儀器PCR試劑購自博邁德生物，GeneAmp PCR System 9700PCR擴(kuò)增儀(PE公司，美國)；北京賽默飛羊血瓊脂培養(yǎng)基；珠海迪爾肉湯培養(yǎng)基；Bruker BioTyper質(zhì)譜分析儀、Flexcontrol 3.4、MALDI Biotyper 3.1、ClinPro Tools軟件3.3.0版本(布魯克公司，德國)；基質(zhì)：a-氰基-4-羥基肉桂酸飽和溶液，2.5%三氟乙酸(sigma)，70%甲酸，乙腈。

1.3方法

1.3.1MLST分型參照網(wǎng)站http://bigsdb.web.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html設(shè)計(jì)7對管家基因的引物、PCR反應(yīng)體系及參數(shù)。產(chǎn)物由北京華大公司進(jìn)行測序，再將序列結(jié)果與MLST網(wǎng)站比對，查詢得出結(jié)果。

1.3.2樣本前處理所有菌株接種于血瓊脂平板，35 ℃孵育18 h后，挑取單個(gè)菌落轉(zhuǎn)種于600 μL肉湯培養(yǎng)基中孵育18 h，13 000×g離心2 min，棄上清液，加入300 μL去離子水混勻，再次離心棄上清液，重復(fù)2次。加入300 μL去離子水混勻，再加入900 μL乙醇，充分混勻，離心棄上清液。室溫下干燥沉淀2～3 min，加入70%甲酸20 μL混勻，再加入20 μL乙腈混勻，離心取1 μL上清液和1 μL的基質(zhì)溶劑混和后置于96孔鋼制靶板表面晾干后上機(jī)。

1.3.3MALDI-TOF MS原理MALDI-TOF MS的原理是根據(jù)特異性保守核糖體蛋白鑒定微生物，在電場和磁場的作用下，測定離子到達(dá)檢測器的飛行時(shí)間而得到質(zhì)荷比(m/z)，其與離子的飛行時(shí)間成正比，從而繪出樣本的蛋白圖譜(指紋圖譜)，通過與數(shù)據(jù)庫中的指紋圖譜相比較來鑒定微生物。用大腸埃希細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行曲線校正，檢測器范圍為2000～20 000 m/z。

1.3.4MSP dendrogram聚類分析通過質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)(MALDI Biotyper軟件)對80張圖譜進(jìn)行聚類分析得出代表親緣關(guān)系遠(yuǎn)近的聚類樹狀圖(main spectrum dendrogram, MSP dendrogram)，分析菌株間的親緣性。

1.3.5MALDI Biotyper建立數(shù)據(jù)庫盲選10株ST11的20張圖譜(同一株菌選取2張，不同的兩個(gè)靶孔)，以及盲選20株OST的20張圖譜(1個(gè)株菌選取1張)，通過MALDI Biotyper建立數(shù)據(jù)庫，其余50株菌用于驗(yàn)證數(shù)據(jù)庫的敏感性和特異性。

1.3.6ClinPro Tools建立模型盲選8株ST11、20株OST，通過ClinPro Tools軟件中的遺傳算法(genetic algorithm, GA)建立模型，并計(jì)算模型的交叉效度與可接受度，該軟件可以對數(shù)據(jù)進(jìn)行坎基線、平滑、標(biāo)準(zhǔn)化、重新校準(zhǔn)，以及平均峰值列表計(jì)算等自動(dòng)化前處理，其余52株菌用于驗(yàn)證模型。

2　結(jié)　果

2.1MSP dendrogram聚類分析結(jié)果MSP dendrogram在距離水平線1000處將80株菌分為兩類，其中42株菌中包含39株OST，另38株菌中包含25株ST11，敏感性為65.78%，特異性為92.85%。而在距離水平線900處可分為3類，分別為11、31、38株(圖1)。

2.2數(shù)據(jù)庫建立及結(jié)果10株ST11和20株OST各自建立數(shù)據(jù)庫，以此數(shù)據(jù)庫為標(biāo)準(zhǔn)，對剩余菌株進(jìn)行檢測，ST11組剩余18株菌中鑒定正確的有17株，OST組剩余32株菌中2株鑒定為ST11，敏感性為89.47%，特異性為96.77%。

2.3模型建立及驗(yàn)證結(jié)果GA計(jì)算所建模型的交叉效度與可接受度均為100%。軟件通過所設(shè)參數(shù)選出模型中ST11的特異性峰有：2761.72、4521.44、5941.94、7790.48、9645.62 m/z。用其余菌株驗(yàn)證模型，20株ST11和32株OST全部分型正確，敏感性和特異性為100%。模型菌株分布見圖2。

3　討　論

MALDI-TOF MS方法鑒定病原微生物準(zhǔn)確性高，且有時(shí)間和成本的優(yōu)勢，使其在臨床微生物檢測領(lǐng)域具有非常廣闊的前景。國外已有許多實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用于臨床實(shí)踐。文獻(xiàn)報(bào)道ClinPro Tools軟件根據(jù)質(zhì)荷比、信噪比、峰下面積等數(shù)據(jù)對菌株進(jìn)行分型，且具有較高的敏感性和特異性。如辨別對甲氧西林敏感與耐藥的金黃色葡萄球菌、準(zhǔn)確快速地鑒別5種高危害克隆型的銅綠假單胞菌、化膿性鏈球菌血清型聚類、以及肺炎支原體亞型分析。本實(shí)驗(yàn)研究探討了通過質(zhì)譜儀配置的MSP dendrogram聚類分析、MALDI Biotyper建立數(shù)據(jù)庫、ClinPro Tools建立模型3種方法對產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌ST11分型的可能性。

圖1　MSP dendrogram 聚類分析結(jié)果圖

×為ST11，o為OST圖2　ST11與OST建立模型菌株分布圖

MSP dendrogram在距離水平線1000處可分為兩類，28株ST11中有25株分為一類，雖然MSP dendrogram聚類分析敏感性不高為65.78%，但特異性為92.85%，表明該法可把ST11與其他型分開。MALDI Biotyper數(shù)據(jù)庫的建立需要>20張圖譜，由于ST11型菌株數(shù)量的限制，我們用同一株菌的兩張圖譜建立數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證結(jié)果顯示18株ST11有1株菌分錯(cuò)，32株OST中有2株菌分錯(cuò)，敏感性為89.47%，特異性為96.77%，說明MALDI Biotyper建立數(shù)據(jù)庫法能較好地區(qū)分ST11與OST，并且該方法最為方便、快速，可在鑒定菌株的同時(shí)對菌株進(jìn)行分型。有文獻(xiàn)報(bào)道，MALDI Biotyper區(qū)分產(chǎn)β-內(nèi)酰胺類大腸埃希菌ST131與ST405和OST的敏感性為98.5%，特異性為93.9%[10]。可能本研究的實(shí)驗(yàn)組與對照組菌株數(shù)量少，限制了MALDI Biotyper區(qū)分ST11的敏感性，需進(jìn)一步收集實(shí)驗(yàn)菌株來研究MALDI Biotyper區(qū)別ST11與OST的能力。

ClinPro Tools軟件通過遺傳算法、快速分類法、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法3種高級數(shù)學(xué)算法計(jì)算所建模型的交叉效度與可接受度。交叉效度是計(jì)算模型可靠性的指標(biāo)，可接受度是衡量數(shù)據(jù)通過模型正確分類的指標(biāo)，并且代表計(jì)算模型的性能，實(shí)驗(yàn)組的可接受度相當(dāng)于敏感性，對照組的可接受度相當(dāng)于特異性[10]。本研究所建模型的交叉效度與可接受度均為100%，并且用剩余菌株驗(yàn)證模型，顯示ClinPro Tools可以正確地區(qū)分ST11和OST，敏感性和特異性均為100%。同時(shí)，ClinPro Tools可以找出模型ST11的特異性峰，分別為2761.72、4521.44、5941.94、7790.48、9645.62 m/z。軟件還可通過受試者工作特征曲線(ROC曲線)計(jì)算ST11的曲線下面積，當(dāng)AUC=1時(shí)，峰值為2761.73，AUC=0.997時(shí)，峰值為4521.42。所以2761.73 m/z和4521.42 m/z可能是ST11的最具特異性峰，表明ClinPro Tools軟件可正確、快速地區(qū)分出產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌ST11型，并且能夠找出其特異性峰。

MALDI-TOF MS可通過3種方法區(qū)別ST11與OST，以ClinPro Tools軟件建立模型方法最可靠。本研究收集的菌株以ST11為主，其他型別菌株數(shù)較少，故未對其他型別的菌株進(jìn)行分組鑒別，有待于進(jìn)一步研究。質(zhì)譜分析技術(shù)操作簡單、成本低、快速準(zhǔn)確，且有文獻(xiàn)報(bào)道MALDI-TOF MS可以快速、準(zhǔn)確地檢測出產(chǎn)碳青霉烯酶的細(xì)菌[11-12]，可作為檢測產(chǎn)碳青酶烯酶肺炎克雷伯菌和對菌株進(jìn)行克隆分型的方法，有進(jìn)一步深入研究的價(jià)值。

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(本文編輯：齊名；英文編輯：王建東)

A studyof typing ST11 of klebsiella pneumoniae producing carbapenemases by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry

LI Xiao-hong1, DING Jin-ya2, LIU Jie3,GONGYan-wen4,XUEWen-cheng5,ZHAOBin6.

1.ClinicalLaboratory,theThirdAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,Xinxiang，Henan453003,China;2.ClinicalLaboratory,GeneralHospitalofGuangzhouMilitaryAreainWuhan,Wuhan，Hubei430070，China;3.ClinicalLaboratory,GeneralHospitalofBeijingMilitaryCommand,Beijing100026，China;4.ClinicalLaboratory,GeneralHospitalofJinanMilitaryCommand,Jinan，Shandong260000，China;5.ClinicalLaboratory,GeneralHospitalofShenyangMilitaryCommand,Shenyang，Liaoning110016，China;6.GeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,Nanjing,Jiangsu210002，China

ObjectiveTo study the probability of typing ST11 of klebsiella pneumoniae producing carbapenemases by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. MethodsFrom October 2012 to October 2014, we collected 80 isolates of klebsiella pneumoniaes producing carbapenemases. We researched all isolates by MLST finding that 28 isolates were ST11 and 52 isolates were other sequence types. Through MSP dendrogram, creating databases by MALDI Biotyper and building models by ClinPro Tools to analysis the probability of typing ST11. ResultsAt the distance level cutoff of 1000, 80 isolates were divided into two clusters. The susceptibility with MSP dendrogram was 65.78%, and the specificity was 92.85%. The results of testing databases were that 1 of 18 ST11 and 2 of 20 OST were false. The susceptibility and the specificity with MALDI Biotyper were respectively 89.47% and 96.77%. The results of checking model with remaining isolates by the ClinPro Tools were all correctly. The susceptibility and specificity were both 100%. ConclusionThrough three methods,MALDI-TOF MS has detection performance for the ST11 and OST, but ClinPro Tools is the best.

ST11; klebsiella pneumonia; carbapenemases;MALDI-TOF MS

遼寧省科技攻關(guān)計(jì)劃(2011225021)

1. 453003河南新鄉(xiāng)，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；2. 430070湖北武漢，廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院檢驗(yàn)科；3. 100026北京，北京軍區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科；4. 260000山東濟(jì)南，濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科；5. 110016遼寧沈陽，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科；6. 210002江蘇南京，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院醫(yī)務(wù)部

趙斌，E-mail:156126607@qq.com

R378

A

10.3969/j.issn.1672-271X.2016.03.005

2016-03-11；

2016-04-25)

引用格式：李曉紅，丁進(jìn)亞，劉杰，等.基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜用于產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌ST11分型的研究.東南國防醫(yī)藥，2016,18(3):240-243.