真核表達(dá)載體pIRES2—AcGFP1—Ascl2的構(gòu)建及表達(dá)

陳彥霞+++++劉津麟+++++李涯松

[摘要] 目的 構(gòu)建真核表達(dá)載體pIRES2-AcGFP1-Ascl2，并在真核細(xì)胞HEK293T細(xì)胞中表達(dá)，為今后研究Ascl2基因在Tfh細(xì)胞的相關(guān)分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法 PCR方法擴(kuò)增健康人外周血單個核細(xì)胞中Ascl2基因，連接至pIRES2-AcGFP1質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建pIRES2-AcGFP1-Ascl2重組質(zhì)粒。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法對HEK293T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。Realtime-PCR及Westernblot方法分析轉(zhuǎn)染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重組質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞中Ascl2表達(dá)情況。結(jié)果 經(jīng)Realtime-PCR及Westernblot方法，證實(shí)Ascl2基因能夠在HEK293T細(xì)胞中正確表達(dá)。結(jié)論 成功建立表達(dá)Ascl2基因的pIRES2-AcGFP1-Ascl2重組質(zhì)粒，并能在HEK293T細(xì)胞中表達(dá)，為進(jìn)一步研究Ascl2在自身免疫性疾病中Tfh細(xì)胞的相關(guān)機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] Ascl2；HEK293T細(xì)胞；Tfh細(xì)胞；自身免疫性疾病

[中圖分類號] R73-3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）21-0005-03

濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞（T follicular helper，Tfh）是近年研究發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞的新亞群[1]。它的特征性標(biāo)志為CXCR5+、PD-1+、ICOS+、CCR7-、Bcl-6+。Tfh細(xì)胞在機(jī)體的生發(fā)中心形成和B細(xì)胞分化中起重要作用，在對維持機(jī)體的免疫平衡發(fā)揮重要作用，它的功能失調(diào)與自身免疫性疾病及免疫缺陷病中扮演重要角色[2-4]。新近研究發(fā)現(xiàn)一種bHLH（basic Helix-Loop-Helix， 堿性螺旋-環(huán)-螺旋）轉(zhuǎn)錄因子：Ascl2（achaete-scute homologue 2）在Tfh細(xì)胞中選擇性的表達(dá)上調(diào)[5]。體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)異位表達(dá)Ascl2能夠上調(diào)T細(xì)胞中的CXCR5的表達(dá)，下調(diào)CCR7表達(dá)，而轉(zhuǎn)錄因子Bcl6則不受影響，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)則證實(shí)異位表達(dá)Ascl2可加速T細(xì)胞遷移到濾泡及Tfh細(xì)胞的發(fā)育[5]。然而，Ascl2 在Tfh細(xì)胞在表達(dá)的具體功能及其調(diào)控Tfh細(xì)胞的具體分子機(jī)制還未完全闡明，本研究旨在建立Ascl2 基因的真核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞并使其表達(dá)，為研究Ascl2對Tfh細(xì)胞的生物學(xué)功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒菌株和HEK293細(xì)胞

pIRES2-AcGFP1質(zhì)粒購買于Clontech公司，大腸桿菌DH5α菌株購買于上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司。HEK293T細(xì)胞購買于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶BglⅡ和SalⅠ，高保真pfu聚合酶以及T4連接酶為美國Fermentas公司產(chǎn)品；質(zhì)粒抽提試劑盒為上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；高糖DMEM培養(yǎng)基購買于Gibco公司；真核轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM2000為Invitrogen公司產(chǎn)品；胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；抗人Ascl2及β-actin抗體為Abcam公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG為美國CST公司產(chǎn)品；引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 HEK293T細(xì)胞的培養(yǎng)

HEK293T細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2孵育箱中貼壁培養(yǎng)，每隔2天用0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)。

1.4 重組質(zhì)粒pIRES2-AcGFP1-Ascl2的構(gòu)建

1.4.1 Ascl2基因的擴(kuò)增 取健康人外周血并用淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞并抽提總RNA，在Pubmed上獲取Ascl2 基因的CDS序列并設(shè)計(jì)引物，加入BglⅡ和SalⅠ 酶切位點(diǎn)，用高保真pfu聚合酶擴(kuò)增Ascl2基因的CDS序列。

1.4.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建 將PCR反應(yīng)電泳回收產(chǎn)物和pIRES2-AcGFP1質(zhì)粒分別由BglⅡ和SalⅠ 限制性內(nèi)切酶37℃雙酶切6 h，進(jìn)行電泳凝膠回收，取5 μL酶切好的PCR片段及質(zhì)粒DNA用T4連接酶4℃連接18 h，使Ascl2與pIRES2-AcGFP1質(zhì)粒連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞在含50μg/mL Kana抗性的LB固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，次日挑取單克隆菌落并加入LB液體培養(yǎng)基上搖菌16 h進(jìn)行大量擴(kuò)增，提取pIRES2-AcGFP1-Ascl2重組質(zhì)粒。

1.5 pIRES2-AcGFP1-Ascl2重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染

將5×105HEK293T細(xì)胞接種于6孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中溫育6 h后使細(xì)胞融合度達(dá)到70%時，分別用250 μL無血清DMEM高糖培養(yǎng)基液稀釋4 μg的質(zhì)粒或10 μL的 LipofectamineTM2000脂質(zhì)體溶液，混勻并放置30 min后。將6孔板中培養(yǎng)液吸出，緩慢將混勻液加入6孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h。6 h后棄去轉(zhuǎn)染液，加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，96 h后收集細(xì)胞并提取總RNA及總蛋白。

1.6 檢測轉(zhuǎn)染pIRES2-AcGFP-Ascl2的HEK293T細(xì)胞中Ascl2的表達(dá)

1.6.1 Realtime-PCR檢測Ascl2 mRNA表達(dá)的檢測根據(jù)GenBank的人Ascl2 基因序列，設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物并由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。上游引物序列：5′AGCCAACCTGAAAACCCACA3′，下游引物序列：5′GAGTCTGAAGGTGCCGGAAA 3′， 設(shè)計(jì)并合成內(nèi)參β-actin引物， 上游引物序列：5′GAATCAATGCAAGTTCGGTTCC 3′， 下游引物序列：5′ TCATCTCCGCTATTAGCTCCG 3′。在轉(zhuǎn)染96 h后提取細(xì)胞總RNA并進(jìn)行real-time PCR。反應(yīng)條件為95℃10 min，95℃ 15 s及60℃ 55 s共40個循環(huán)，各組mRNA同內(nèi)參β-actin基因相比得到相對表達(dá)量并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。endprint

1.6.2 Western blotting檢測Ascl2蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒96 h后的HEK293T細(xì)胞，吸去原培養(yǎng)液，PBS洗3次，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白。95℃變性10 min。變性后樣本在100 g/L聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分離電泳（200 V，40 min），然后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)至硝化纖維膜（60 V，120 min）。將載有蛋白質(zhì)的纖維膜用0.1% Triton-PBS溶液漂洗3次，10 min/次，并用脫脂奶粉封閉NC膜0.5 h，分別加入Ascl2和β-actin一抗4℃孵育16 h，再用1×TBST洗膜3次，10 min/次，充分洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)種屬IgG二抗室溫孵育0.5 h，再用1×TBST洗膜3次，10 min/次，最終漂洗后用ECL顯色試劑盒進(jìn)行顯色，在顯色后進(jìn)行曝光。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用曼-惠特尼U檢驗(yàn)分析HEK293T細(xì)胞和HEK293T-Ascl2細(xì)胞之間mRNA表達(dá)水平的差異，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ascl2基因的提取與鑒定

PCR擴(kuò)增外周血單個核細(xì)胞中Ascl2基因CDS序列后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測，可見581bp的特異條帶， 與pubmed上公布的Ascl2基因的CDS序列大小一致（圖1）。

圖1 PCR方法擴(kuò)增健康人外周血單個核細(xì)胞中Ascl2基因

（A：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；B：PCR產(chǎn)物）

2.2 Ascl2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建

將PCR擴(kuò)增出的581bp的基因片段與空載體 pIRES2-AcGFP1連接成功后，用BglⅡ和SalⅠ雙酶切鑒定（圖 2），并送測序，結(jié)果用 BLAST軟件進(jìn)行分析，與 Pubmed中GenBank公布的序列一致。

圖 2 重組質(zhì)粒 pIRES2-AcGFP1-Ascl2的酶切鑒定

（A：DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)； B： pIRES2-AcGFP1-Ascl2/BglII+SalI）

2.3 轉(zhuǎn)染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重組質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞中Ascl2的mRNA及蛋白水平的檢測

2.3.1 Real Time PCR檢測Ascl2的mRNA結(jié)果 HEK293T-Ascl2細(xì)胞組Ascl2的mRNA表達(dá)量明顯高于人HEK293T細(xì)胞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0235）（圖3）。

圖3 Real Time PCR檢測轉(zhuǎn)染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重組質(zhì)粒96 h后各組Ascl2的mRNA表達(dá)水平

2.3.2 Western blotting檢測Ascl2蛋白表達(dá) 在約28kDa（Ascl2）、42kDa（β-actin）處見到特異性條帶，Ascl2-HEK293T組條帶顏色相比HEK293T組顏色明顯加深（圖4），表明重組pIRES2-AcGFP1-Ascl2質(zhì)粒能在HEK293T細(xì)胞中正確表達(dá)及翻譯（圖4）。

圖4 Western blotting檢測轉(zhuǎn)染pIRES2-AcGFP-Ascl2重組質(zhì)粒96 h后各組Ascl2蛋白的表達(dá)情況

3 討論

Tfh細(xì)胞是表達(dá)Ascl2的新型CD4+效應(yīng)性T細(xì)胞亞群，其特征是能夠遷移并定位于淋巴濾泡、產(chǎn)生IL-21等細(xì)胞因子、表達(dá)ICOS等共刺激分子，從而最終輔助B細(xì)胞發(fā)揮體液免疫的功能[6-9]。但關(guān)于Tfh細(xì)胞的研究仍有許多重要問題有待進(jìn)一步深入探討，如Ascl2在機(jī)體發(fā)生自身免疫性疾病時，轉(zhuǎn)錄因子Ascl2是怎樣參與Tfh細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展的，是否可以通過有效抑制Tfh細(xì)胞的Ascl2 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來治療自身免疫性疾病等，隨著研究的不斷深入，Tfh細(xì)胞中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄分子以及表面分子等將成為治療臨床自身免疫性疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)[2，10]。

為此，在本研究中我們通過慢病毒pIRES2-AcGFP1穿梭載體，將Ascl2和綠色熒光AcGFP1基因構(gòu)建在一起，這將有利于對Tfh細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子Ascl2進(jìn)行定位和示蹤。另外，通過pIRES2-AcGFP1穿梭載體的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（IRES），達(dá)到GFP基因和Ascl2 的分別表達(dá)，從而排除了AcGFP1熒光蛋白對Ascl2 蛋白功能的影響，從而為下一步研究Ascl2分子在Tfh細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病中的作用及具體信號通路建立了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，將有助于進(jìn)一步闡明自身免疫性疾病中Ascl2 分子通過何種機(jī)制促進(jìn)Tfh細(xì)胞大量產(chǎn)生從而進(jìn)一步輔助B細(xì)胞產(chǎn)生大量的自身抗體，從而對臨床系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及潰瘍性結(jié)腸炎等自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)一步了解。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Ma CS，Deenick EK. Human T follicular helper （Tfh） cells and disease[J]. Immunol Cell Biol，2014，92（1）：64-71.

[2] Craft JE. Follicular helper T cells in immunity and systemic autoimmunity[J]. Nat Rev Rheumatol，2012，8（6）：337-347.

[3] Zhang X，Ing S，F(xiàn)raser A，et al. Follicular helper T cells： new insights into mechanisms of autoimmune diseases[J]. Ochsner J，2013，13（1）：131-139.

[4] Liu X，Yan X，Zhong B，et al. Bcl6 expression specifies the T follicular helper cell program in vivo[J]. J Exp Med，2012，209（10）：1841-1852，S1841-1824.

[5] Liu X，Chen X，Zhong B，et al. Transcription factor achaete-scute homologue 2 initiates follicular T-helper-cell development[J]. Nature，2014，507（7493）：513-518.

[6] Yang X， Yang J， Chu Y， et al. T follicular helper cells mediate expansion of regulatory B cells via IL-21 in Lupus-prone MRL/lpr mice[J]. PLoS One， 2013，8（4）：e62855.

[7] King C，Tangye SG，Mackay CR. T follicular helper （TFH） cells in normal and dysregulated immune responses[J]. Annu Rev Immunol，2008，26：741-766.

[8] Shekhar S，Yang X. The darker side of follicular helper T cells： from autoimmunity to immunodeficiency[J]. Cell Mol Immunol，2012，9（5）：380-385.

[9] Xu H，Li X，Liu D，et al. Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility[J]. Nature，2013，496（7446）：523-527.

[10] Liu X，Nurieva RI，Dong C. Transcriptional regulation of follicular T-helper（Tfh） cells[J]. Immunol Rev，2013， 252（1）：139-145.

（收稿日期：2014-04-22）endprint

1.6.2 Western blotting檢測Ascl2蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒96 h后的HEK293T細(xì)胞，吸去原培養(yǎng)液，PBS洗3次，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白。95℃變性10 min。變性后樣本在100 g/L聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分離電泳（200 V，40 min），然后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)至硝化纖維膜（60 V，120 min）。將載有蛋白質(zhì)的纖維膜用0.1% Triton-PBS溶液漂洗3次，10 min/次，并用脫脂奶粉封閉NC膜0.5 h，分別加入Ascl2和β-actin一抗4℃孵育16 h，再用1×TBST洗膜3次，10 min/次，充分洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)種屬IgG二抗室溫孵育0.5 h，再用1×TBST洗膜3次，10 min/次，最終漂洗后用ECL顯色試劑盒進(jìn)行顯色，在顯色后進(jìn)行曝光。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用曼-惠特尼U檢驗(yàn)分析HEK293T細(xì)胞和HEK293T-Ascl2細(xì)胞之間mRNA表達(dá)水平的差異，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ascl2基因的提取與鑒定

PCR擴(kuò)增外周血單個核細(xì)胞中Ascl2基因CDS序列后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測，可見581bp的特異條帶， 與pubmed上公布的Ascl2基因的CDS序列大小一致（圖1）。

圖1 PCR方法擴(kuò)增健康人外周血單個核細(xì)胞中Ascl2基因

（A：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；B：PCR產(chǎn)物）

2.2 Ascl2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建

將PCR擴(kuò)增出的581bp的基因片段與空載體 pIRES2-AcGFP1連接成功后，用BglⅡ和SalⅠ雙酶切鑒定（圖 2），并送測序，結(jié)果用 BLAST軟件進(jìn)行分析，與 Pubmed中GenBank公布的序列一致。

圖 2 重組質(zhì)粒 pIRES2-AcGFP1-Ascl2的酶切鑒定

（A：DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)； B： pIRES2-AcGFP1-Ascl2/BglII+SalI）

2.3 轉(zhuǎn)染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重組質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞中Ascl2的mRNA及蛋白水平的檢測

2.3.1 Real Time PCR檢測Ascl2的mRNA結(jié)果 HEK293T-Ascl2細(xì)胞組Ascl2的mRNA表達(dá)量明顯高于人HEK293T細(xì)胞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0235）（圖3）。

圖3 Real Time PCR檢測轉(zhuǎn)染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重組質(zhì)粒96 h后各組Ascl2的mRNA表達(dá)水平

2.3.2 Western blotting檢測Ascl2蛋白表達(dá) 在約28kDa（Ascl2）、42kDa（β-actin）處見到特異性條帶，Ascl2-HEK293T組條帶顏色相比HEK293T組顏色明顯加深（圖4），表明重組pIRES2-AcGFP1-Ascl2質(zhì)粒能在HEK293T細(xì)胞中正確表達(dá)及翻譯（圖4）。

圖4 Western blotting檢測轉(zhuǎn)染pIRES2-AcGFP-Ascl2重組質(zhì)粒96 h后各組Ascl2蛋白的表達(dá)情況

3 討論

Tfh細(xì)胞是表達(dá)Ascl2的新型CD4+效應(yīng)性T細(xì)胞亞群，其特征是能夠遷移并定位于淋巴濾泡、產(chǎn)生IL-21等細(xì)胞因子、表達(dá)ICOS等共刺激分子，從而最終輔助B細(xì)胞發(fā)揮體液免疫的功能[6-9]。但關(guān)于Tfh細(xì)胞的研究仍有許多重要問題有待進(jìn)一步深入探討，如Ascl2在機(jī)體發(fā)生自身免疫性疾病時，轉(zhuǎn)錄因子Ascl2是怎樣參與Tfh細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展的，是否可以通過有效抑制Tfh細(xì)胞的Ascl2 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來治療自身免疫性疾病等，隨著研究的不斷深入，Tfh細(xì)胞中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄分子以及表面分子等將成為治療臨床自身免疫性疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)[2，10]。

為此，在本研究中我們通過慢病毒pIRES2-AcGFP1穿梭載體，將Ascl2和綠色熒光AcGFP1基因構(gòu)建在一起，這將有利于對Tfh細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子Ascl2進(jìn)行定位和示蹤。另外，通過pIRES2-AcGFP1穿梭載體的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（IRES），達(dá)到GFP基因和Ascl2 的分別表達(dá)，從而排除了AcGFP1熒光蛋白對Ascl2 蛋白功能的影響，從而為下一步研究Ascl2分子在Tfh細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病中的作用及具體信號通路建立了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，將有助于進(jìn)一步闡明自身免疫性疾病中Ascl2 分子通過何種機(jī)制促進(jìn)Tfh細(xì)胞大量產(chǎn)生從而進(jìn)一步輔助B細(xì)胞產(chǎn)生大量的自身抗體，從而對臨床系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及潰瘍性結(jié)腸炎等自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)一步了解。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Ma CS，Deenick EK. Human T follicular helper （Tfh） cells and disease[J]. Immunol Cell Biol，2014，92（1）：64-71.

[2] Craft JE. Follicular helper T cells in immunity and systemic autoimmunity[J]. Nat Rev Rheumatol，2012，8（6）：337-347.

[3] Zhang X，Ing S，F(xiàn)raser A，et al. Follicular helper T cells： new insights into mechanisms of autoimmune diseases[J]. Ochsner J，2013，13（1）：131-139.

[4] Liu X，Yan X，Zhong B，et al. Bcl6 expression specifies the T follicular helper cell program in vivo[J]. J Exp Med，2012，209（10）：1841-1852，S1841-1824.

[5] Liu X，Chen X，Zhong B，et al. Transcription factor achaete-scute homologue 2 initiates follicular T-helper-cell development[J]. Nature，2014，507（7493）：513-518.

[6] Yang X， Yang J， Chu Y， et al. T follicular helper cells mediate expansion of regulatory B cells via IL-21 in Lupus-prone MRL/lpr mice[J]. PLoS One， 2013，8（4）：e62855.

[7] King C，Tangye SG，Mackay CR. T follicular helper （TFH） cells in normal and dysregulated immune responses[J]. Annu Rev Immunol，2008，26：741-766.

[8] Shekhar S，Yang X. The darker side of follicular helper T cells： from autoimmunity to immunodeficiency[J]. Cell Mol Immunol，2012，9（5）：380-385.

[9] Xu H，Li X，Liu D，et al. Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility[J]. Nature，2013，496（7446）：523-527.

[10] Liu X，Nurieva RI，Dong C. Transcriptional regulation of follicular T-helper（Tfh） cells[J]. Immunol Rev，2013， 252（1）：139-145.

（收稿日期：2014-04-22）endprint

1.6.2 Western blotting檢測Ascl2蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒96 h后的HEK293T細(xì)胞，吸去原培養(yǎng)液，PBS洗3次，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白。95℃變性10 min。變性后樣本在100 g/L聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分離電泳（200 V，40 min），然后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)至硝化纖維膜（60 V，120 min）。將載有蛋白質(zhì)的纖維膜用0.1% Triton-PBS溶液漂洗3次，10 min/次，并用脫脂奶粉封閉NC膜0.5 h，分別加入Ascl2和β-actin一抗4℃孵育16 h，再用1×TBST洗膜3次，10 min/次，充分洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)種屬IgG二抗室溫孵育0.5 h，再用1×TBST洗膜3次，10 min/次，最終漂洗后用ECL顯色試劑盒進(jìn)行顯色，在顯色后進(jìn)行曝光。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用曼-惠特尼U檢驗(yàn)分析HEK293T細(xì)胞和HEK293T-Ascl2細(xì)胞之間mRNA表達(dá)水平的差異，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ascl2基因的提取與鑒定

PCR擴(kuò)增外周血單個核細(xì)胞中Ascl2基因CDS序列后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測，可見581bp的特異條帶， 與pubmed上公布的Ascl2基因的CDS序列大小一致（圖1）。

圖1 PCR方法擴(kuò)增健康人外周血單個核細(xì)胞中Ascl2基因

（A：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；B：PCR產(chǎn)物）

2.2 Ascl2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建

將PCR擴(kuò)增出的581bp的基因片段與空載體 pIRES2-AcGFP1連接成功后，用BglⅡ和SalⅠ雙酶切鑒定（圖 2），并送測序，結(jié)果用 BLAST軟件進(jìn)行分析，與 Pubmed中GenBank公布的序列一致。

圖 2 重組質(zhì)粒 pIRES2-AcGFP1-Ascl2的酶切鑒定

（A：DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)； B： pIRES2-AcGFP1-Ascl2/BglII+SalI）

2.3 轉(zhuǎn)染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重組質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞中Ascl2的mRNA及蛋白水平的檢測

2.3.1 Real Time PCR檢測Ascl2的mRNA結(jié)果 HEK293T-Ascl2細(xì)胞組Ascl2的mRNA表達(dá)量明顯高于人HEK293T細(xì)胞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0235）（圖3）。

圖3 Real Time PCR檢測轉(zhuǎn)染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重組質(zhì)粒96 h后各組Ascl2的mRNA表達(dá)水平

2.3.2 Western blotting檢測Ascl2蛋白表達(dá) 在約28kDa（Ascl2）、42kDa（β-actin）處見到特異性條帶，Ascl2-HEK293T組條帶顏色相比HEK293T組顏色明顯加深（圖4），表明重組pIRES2-AcGFP1-Ascl2質(zhì)粒能在HEK293T細(xì)胞中正確表達(dá)及翻譯（圖4）。

圖4 Western blotting檢測轉(zhuǎn)染pIRES2-AcGFP-Ascl2重組質(zhì)粒96 h后各組Ascl2蛋白的表達(dá)情況

3 討論

Tfh細(xì)胞是表達(dá)Ascl2的新型CD4+效應(yīng)性T細(xì)胞亞群，其特征是能夠遷移并定位于淋巴濾泡、產(chǎn)生IL-21等細(xì)胞因子、表達(dá)ICOS等共刺激分子，從而最終輔助B細(xì)胞發(fā)揮體液免疫的功能[6-9]。但關(guān)于Tfh細(xì)胞的研究仍有許多重要問題有待進(jìn)一步深入探討，如Ascl2在機(jī)體發(fā)生自身免疫性疾病時，轉(zhuǎn)錄因子Ascl2是怎樣參與Tfh細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展的，是否可以通過有效抑制Tfh細(xì)胞的Ascl2 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來治療自身免疫性疾病等，隨著研究的不斷深入，Tfh細(xì)胞中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄分子以及表面分子等將成為治療臨床自身免疫性疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)[2，10]。

為此，在本研究中我們通過慢病毒pIRES2-AcGFP1穿梭載體，將Ascl2和綠色熒光AcGFP1基因構(gòu)建在一起，這將有利于對Tfh細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子Ascl2進(jìn)行定位和示蹤。另外，通過pIRES2-AcGFP1穿梭載體的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（IRES），達(dá)到GFP基因和Ascl2 的分別表達(dá)，從而排除了AcGFP1熒光蛋白對Ascl2 蛋白功能的影響，從而為下一步研究Ascl2分子在Tfh細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病中的作用及具體信號通路建立了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，將有助于進(jìn)一步闡明自身免疫性疾病中Ascl2 分子通過何種機(jī)制促進(jìn)Tfh細(xì)胞大量產(chǎn)生從而進(jìn)一步輔助B細(xì)胞產(chǎn)生大量的自身抗體，從而對臨床系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及潰瘍性結(jié)腸炎等自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)一步了解。

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（收稿日期：2014-04-22）endprint