轉錄因子Klfs家族影響肝細胞癌發生發展的機制研究進展*

董笑　李琦

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轉錄因子Klfs家族影響肝細胞癌發生發展的機制研究進展*

董笑李琦

摘要肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國常見的惡性腫瘤之一，死亡率高，其發生與發展的具體分子機制尚不明確。Krüppel樣因子家族（Klfs）是具有鋅指結構的高度保守的轉錄因子家族，共包括17個家族成員。近年來，關于Klfs與肝癌發病機制的研究不斷深入，發現Klf2、Klf4、Klf5等家族成員參與肝癌細胞的增殖、分化和浸潤轉移等過程。本文就Klfs家族成員的功能以及在肝癌發生發展中的作用機制進行綜述。

關鍵詞轉錄因子Krüppel樣因子肝細胞癌抑癌基因癌基因

作者單位：上海交通大學附屬第一人民醫院腫瘤中心（上海市200080）

*本文課題受國家自然科學基金項目（編號：81272714，81572310）資助

原發性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，死亡率高，預后極差，據WHO統計，2012年占惡性腫瘤死亡率第2位，50%以上的肝癌病例發生在中國［1］。肝細胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的原發性肝癌病理類型，占肝癌總數的75%～80%。雖然已有研究表明，HGF/c-MET、RAF/MEK/ERK等信號通路的活化參與了HCC的發生、侵襲和轉移［2］，但這些通路的上游轉錄調控機制尚不明確。

1 HCC演進過程中的可能分子機制

HCC的演進是一個復雜、長期、多因素參與的過程，其中涉及的分子機制可能包括：1）間質微環境的改變：如細胞外基質組成成分的改變及蛋白水解酶活力的增強；2）腫瘤相關基因的突變：如p21、p53基因等；3）細胞信號通路異常：如影響細胞分化和發育的Hedgehog通路；影響細胞增殖的HGF/HGFR、RAS/ RAF/MEK/ERK和PI3K/AKT/mTOR通路；影響腫瘤上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程的Wnt/β-catenin通路、VEGF/VEGFR通路等。而Klfs家族作為這些通路的上游轉錄調控分子，在肝癌的發生與發展過程中發揮重要的作用。

2 肝癌相關Klfs家族的結構和功能

Klfs家族相同的結構特點為羧基末端具有高度保守的串聯的C2H2鋅指結構，由2個半胱氨酸和2個組氨酸殘基構成，通過鋅指結構結合到目標靶基因序列上相似的GC/GT/CACCC位點，發揮特定的基因轉錄調控功能。而Klfs家族的氨基末端大都不同，可以結合不同的激活因子與抑制因子，這就導致了Klfs家族成員功能的多樣性。Klfs家族成員通過轉錄調控下游靶基因的表達而在細胞生長、增殖、分化和凋亡過程中發揮重要作用。目前，已報道共有7個Klfs家族成員（Klf2、Klf4、Klf5、Klf6、Klf8、Klf9、Klf17）參與肝癌的發生與進展［3-9］。

2.1 Klf4與肝癌

Klf4主要在胃腸道、血管內皮細胞中表達，故稱“胃腸富集型Klf”。在不同的腫瘤中，Klf4發揮不同的調節作用。在食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、腸癌等多種腫瘤中，Klf4發揮抑癌基因的作用［10-14］。研究表明Klf4主要通過以下機制發揮抑癌基因作用：1）抑制Wnt/β-catenin信號通路［15］；2）上調Notch通路抑制腫瘤的發生發展［16］；3）抑制腫瘤EMT［14］：此過程涉及多種信號通路，主要包括ERK通路活化、PI3K/AKT、Wnt/β-catenin信號通路、NF-κB通路、VEGF通路、TGF-β等，參與APC信號轉導通路；4）誘導腫瘤干細胞增殖［17］；5）激活p53、p21等抑癌基因［18］。

Klf4的表達水平與肝癌細胞分化程度相關。Hsu等［18］發現高分化肝癌細胞中細胞增殖指數Ki-67更低，Kaplan-Meier分析顯示Klf4高表達的肝癌細胞分化程度較高且5年生存率較高。Sun等［4］研究表明Klf4通過誘導核因子6（HNF6）表達提高肝癌細胞分化能力。Zhou等［19］構建特征性Klf4非編碼轉錄體即Klf4-003，其表達下降與肝癌復發相關，去甲基化處理后可恢復Klf4-003的表達。

Klf4通過上調下游靶基因及金屬蛋白酶的表達抑制EMT過程。Sureban等［20］證實敲除肝癌細胞中的腫瘤干細胞標記物DCLK1（tumor stem cell marker double cortin-like kinase1）后，Klf4表達下降，同時EMT過程的抑制因子miR-200家族表達下降；Klf4被誘導過表達后，miR-200家族成員miR-200a、miR-200b、miR-200c表達明顯升高，其機制為Klf4基因可直接與miR-200家族啟動子區結合，轉錄調控miR-200家族的表達。Sung等［21］首次證實在具高度侵襲性的肝癌細胞中過表達Klf4后，金屬蛋白酶抑制劑TIMP-1和TIMP-2表達上調，抑制EMT過程。Li等［11］在肝癌的研究中發現，Klf4是一種抑癌基因，轉染Klf4基因的肝癌細胞增殖明顯受到抑制，亦影響了EMT相關標記物的表達。Klf4基因還通過結合維生素D3受體（VDR）啟動子區，直接轉錄調控VDR基因的表達。Klf4基因外顯子區域高甲基化導致其表達缺失，抑制了VDR的表達活性，使VitD3-VDR抗肝癌細胞增殖效應的作用下降，影響了肝癌的發生、侵襲和轉移等生物學特性。

2.2 Klf6與肝癌

2.2.1 Klf6結構的特殊性Klf6基因位于10p15，由4個外顯子構成，除羧基末端3個高度保守的鋅指結構域外，氨基末端還包含1個絲氨酸/蘇氨酸富集及1個酸性結構域，具有轉錄激活功能。Klf6在胎盤中高度表達，被認為是癌胚抗原基因家族。Klf6基因有3個剪接變異體（SV1、SV2、SV3）。在前列腺癌、神經膠質細胞瘤、結直腸癌、肝癌等惡性腫瘤中Klf6是一種腫瘤抑制因子，不同的剪接變異體可以在不同腫瘤的起源、發展過程中發揮不同作用［22-23］。

2.2.2 Klf6在肝癌中的調節機制Klf6 SV1在肝癌組織中表達升高，被認為是促癌基因［24-25］，而Klf6 SV2的作用仍存在爭議。Zhou等［6］研究發現，在肝癌組織及細胞系中，Klf6 SV2表達水平較正常組織中升高。Sirach等［26］研究發現，Klf6基因敲除后，肝癌細胞中Rb磷酸化水平和Bcl-xL表達明顯被抑制，從而產生抗細胞增殖和促進細胞凋亡的作用。由于此研究使用的siRNA序列與野生型Klf6及其變異體相似，故敲除Klf6基因產生的抗癌作用應歸因于SV1的非特異性敲除。另外，其他大多數研究表明野生型Klf6、Klf6 SV2是抑癌因子，在肝癌組織及細胞系中發揮抗細胞增殖、促進細胞凋亡的作用［23，27-30］。

Klf6可調節多種參與肝癌發生和發展過程中的基因。研究表明，野生型Klf6和Klf6 SV2可以增強其下游靶基因p21的表達，發揮抑癌作用［31］，而SV1抑制p21的表達，促進癌細胞增殖［32］。Liang等［24］發現Klf6-FL（full-length）可以抑制腫瘤細胞增殖、遷移，而SV1與其有相反作用。利用生物學及熒光素酶標記法篩查出Klf6-FL是miR-1301和miR-210的靶基因，肝癌組織標本中存在miR-1301過表達及miR-1301基因甲基化和乙酰化。Lee等［27］研究發現Klf6基因抑制癌基因PTTG1轉錄過程。敲除Klf6后，因PTTG1表達上調導致肝癌細胞增殖。Tarocchi等［29］發現Klf6抑制MDM2蛋白的表達，并下調p53基因的活性或減少p53基因的表達，發揮抑制腫瘤生長的作用。

2.3 Klf8與肝癌

目前的研究表明Klf8是肝細胞癌的促癌基因［7，33- 34］。Han等［33］認為肝癌浸潤及轉移首先是MMPs等基質金屬蛋白酶降解細胞外基質，進而癌細胞通過EMT過程從原發病灶脫離，進入周圍組織和血液、淋巴循環，發生浸潤和轉移。MMP-9是MMP家族中的一員，具有降解變性膠原和Ⅳ型膠原蛋白的功能，與肝癌的進展及低生存率密切相關。研究顯示，Klf8蛋白表達水平與MMP-9含量呈正相關［33］，這表明MMP-9可能是Klf8的下游靶基因，上調Klf8基因的表達導致肝癌細胞株MMP-9的活性增加，促進癌細胞的浸潤及轉移。相關研究發現，肝癌組織Klf8的表達水平與黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）表達水平呈正相關［33］，FAK基因過表達可促進肝癌的轉移，這表明Klf8可能受FAK調控，但具體信號通路機制尚不明確。成撒諾等［34］研究表明Klf8基因在肝癌中參與調控血管生成，即Klf8通過PI3K/ AKT信號通路誘導VEGF的表達，Klf8高表達的肝癌細胞具有更強的誘導新血管生成潛能。Yang等［7］研究發現Klf8及β-catenin蛋白表達水平在高分化肝癌中顯著升高，進一步研究提示Klf8參與了腫瘤浸潤和轉移過程中的重要信號通路-Wnt/β-catenin的轉錄調控。一方面，Wnt3a可以刺激Klf8表達水平升高；另一方面Klf8過表達提高了β-catenin對TCF4（T-cell factor 4）轉錄因子的招募能力，進而誘導Wnt/β-catenin信號通路靶基因c-Myc、cyclin D1及Axin1表達。

2.4 Klf17與肝癌

Liu等［9］分析了60例肝癌組織中Klf17表達水平與生存率之間的關系，結果顯示Klf17高表達、低表達患者5年生存率分別為63%、41%（P=0.034）。Klf17低表達組中，發生淋巴結及遠處轉移的概率更高。Sun等［35］發現miR-9過表達促進肝癌細胞轉移和浸潤，HepG2肝癌細胞中miR-9表達水平較正常肝細胞增高1 000倍，利用熒光素酶分析顯示miR-9通過結合Klf17基因3'UTR抑制Klf17基因表達，共轉染miR-9后，Hep12肝癌細胞中Klf17蛋白表達下調；抑制miR-9表達后，則Klf17蛋白表達上調。Klf17直接結合波形蛋白、ZO-1、S粘連蛋白的啟動子區域，通過上皮間質轉化過程，抑制肝癌浸潤與遠處轉移。

3 Klf家族的其他因子與肝癌

3.1 Klf2與肝癌

有關Klf2基因與肝癌的關系研究甚少。Huang等［3］研究顯示，Klf2基因過表達可以抑制肝癌細胞增殖、促進肝癌細胞凋亡。長鏈非編碼RNA（LncRNA）TUG1在肝癌組織中表達上調，通過結合EZH2和SUZ12抑制Klf2轉錄過程。

3.2 Klf5與肝癌

Shibata等［36］利用全基因測序方法，發現10%～30%肝癌細胞中存在Wnt/β-catenin信號通路的關鍵調節因子CTNNB1外顯子的突變，CD44和c-Myc蛋白恰是CTNNB1外顯子的作用靶點，此通路的異常活化促進肝癌細胞的生長。Klf5基因可以間接調節腫瘤干細胞（cancer stem-like cells，CSCs）標志物CD44表達，促成CSCs的惡性生物學行為［36-37］。Liu等［38］進一步提出在肝癌細胞株MHCC97的侵襲與遠處轉移過程中存在c-Myc/miR-17-5p反饋環路。

3.3 Klf9與肝癌

據Fu等［39］報道，肝癌組織中Klf9 mRNA及Klf9蛋白表達水平均降低，HepG2細胞中Klf9表達上調具有抗增殖、促凋亡的作用。程序性死亡蛋白5 （PDCD5）作為一個凋亡促進因子，可以直接與Klf9基因啟動子區3'端的131～692 bp結構域結合繼而上調Klf9的表達。Klf9高表達的患者不易發生淋巴結轉移。Sun等［8］研究發現，Klf9基因可結合p53基因啟動子而上調p53表達水平。該研究的動物實驗亦證實Klf9過表達可明顯抑制肝癌的發展。以上研究均表明Klf9基因在肝癌的發生與發展過程中發揮抑癌作用。

4 前景與展望

目前關于Klf家族在肝癌發生與發展過程中調控網絡的研究并不全面，Klf的17個家族成員中僅7個成員與肝癌相關。而這7個成員之間的相互作用機制尚不明確，亦缺乏有關其他成員在肝癌演進過程中的研究。另外，關于miRNA、LncRNA與Klf家族的關系亦缺乏深入探討。期待發掘其他參與肝癌進展的Klf家族成員，這可能為肝癌的分子診斷和藥物診療提供新的方向。

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（2016-01-12收稿）

（2016-03-30修回）

Mechanism of transcription factors KLFs in the occurrence and development of HCC

Xiao DONG, Qi LI
Correspondence to: Qi LI, E-mail: Leeqi2001@hotmail.com
Department of Oncology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200080, China
This work was supported by the Natural Science Foundation of China (No.81272714 and 81572310)

AbstractHepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most lethal human cancers in China.The specific molecular mechanism of its occurrence and development is unclear.Krüppel-like factor family (KLF), which includes 17 members, is a highly conserved transcription factor family with zinc finger structure.The mechanism of KLFs and the pathogenesis of HCC have been studied in recent years.Research revealed that KLF2, KLF4, KLF5, and other KLF family members could be involved in the progression of proliferation, differentiation, invasion, and metastasis of HCC.This review summarizes the function and the mechanism of transcription factors KLF in the occurrence and development of HCC.

Keywords:transcription factors, Krüppel-like factor, hepatocellular carcinoma, tumor suppressor gene, oncogene

doi:10.3969/j.issn.1000-8179.2016.08.047

通信作者：李琦Leeqi2001@hotmail.com

作者簡介

董笑專業方向為腫瘤分子靶向治療。

E-mail：dongxiao92@outlook.com

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