精子DNA損傷與男性精液常規質量參數的關系*

包華瓊孫 嵐伊宏亮 柴路維 楊學妞 丁 杰 蔡 敏

重慶市人口和計劃生育科學技術研究院附屬醫院，重慶市出生缺陷與生殖健康重點實驗室（重慶　400020）

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精子DNA損傷與男性精液常規質量參數的關系*

包華瓊△**孫 嵐△伊宏亮 柴路維 楊學妞 丁 杰 蔡 敏

重慶市人口和計劃生育科學技術研究院附屬醫院，重慶市出生缺陷與生殖健康重點實驗室（重慶400020）

△共同第一作者

據報道， 近50年來男性精液質量持續下降，不育癥的發病率越來越高，有10%的育齡夫婦患有不孕癥，其中約50%是丈夫精液質量下降引起［1］。精液常規質量分析雖是男性生育能力的主要評估指標，但它在全面評價精子的受精能力等方面有一定局限性。近年來臨床研究表明：在特發性不育中，有近20%的患者有高水平的精子DNA損傷［2］。這說明精子DNA損傷可能是男性不育的重要因素之一。本研究通過分析精子DNA損傷率與精液常規質量參數的相關性，探討精子DNA損傷檢測在男性不育診治中的臨床價值，為男性不育患者的診斷及治療提供依據。

材料與方法

一、研究對象

所有精液標本于2012年5月至2014年12月在重慶計生醫院生殖中心和西南醫院生殖中心收集。隨機選取296例不育男性為實驗組，40例正常生育男性為對照組，分別對兩組精液進行常規質量參數分析；用SCD法檢測精子DNA損傷率，并根據損傷程度（DNA損傷率＜25%，≥25%）將296例不育男性分為兩組。所有研究對象年齡在22～40歲，平均年齡（32.5±5.2）歲；無性功能障礙病史、無遺傳性疾病家族史及外傷，體檢未發現明顯的附睪、睪丸及輸精管異常；有隱睪癥、無精子癥、精索靜脈曲張、腮腺炎病史患者已排除。

二、精液標本收集

所有精液收集和質量檢查參照WHO第五版標準和操作程序［3 ，4］。男方禁欲2～7d，手淫法取全部精液于無菌取精杯中，置37℃水浴箱內液化后充分混勻，采用計算機輔助精液分析檢測精液常規、動態及形態參數。

三、精子DNA損傷檢測

精子DNA 損傷檢測試劑盒購自深圳市博銳德生物科技有限公司。所有操作步驟參照試劑說明書進行。

1. 精子標本處理：新鮮精液行常規檢查后稀釋濃度為（5～10）×106/mL，取60μL 加入已熔化的易熔凝膠管中充分混勻，37℃孵育待用。

2. 變性處理：取30μL精子凝膠混合液包被于已預冷的載玻片上，置于2～8℃冰箱使其凝固，5min后小心移去蓋玻片，將載玻片立即垂直浸入反應液A池，室溫反應7min后，再將載玻片浸入反應液B池中反應25min；最后將載玻片水平浸入大量純化水中洗滌1～2次，每次5min。

3. 脫水、染色：將變性處理后的載玻片依次置于70%、90% 和100% 的梯度乙醇中脫水，各2min。待干燥后用瑞氏染液覆蓋，30s后緩慢加入瑞氏緩沖液，充分混勻。15min后流水沖洗，干燥備用。

4. 精子DNA損傷率計算：采用精子染色質擴散法（SCD）檢測原理，根據光暈的有無和大小判斷精子DNA損傷程度，顯微鏡下計數500個精子。計算公式為：精子DNA損傷率（%）=存在DNA損傷精子數/被觀察精子總數×100%。精子DNA損傷率＜25%記為正常。

四、統計學分析

用 SPASS17.0統計軟件進行分析，所有計量資料用（x±s）表示，行t檢驗；相關性分析采用Spearman法。

結　果

一、實驗組與對照組精液參數比較

與對照組相比，實驗組不育男性精子DNA損傷率顯著升高，而前向運動精子率、精子活動率顯著降低（P＜0.05）。兩組之間年齡、精液量、精子濃度、精子總數、精子正常形態率也有一定差異，但無統計學意義（P＞0.05），（見表1）。

表1　實驗組與對照組各項精液參數比較（±s）

表1　實驗組與對照組各項精液參數比較（±s）

*與對照組相比，P＜0.05

項目　　對照組（n=40）　　實驗組（n=296）年齡（歲）　33.5±5.5　32.4±4.9精液量（mL）　3.8±1.5　3.2±1.2精液濃度（×106/mL）　65.1±31.4　58.7±39.3精子總數（×106）　238.9±153.4　200.9±132.6前向運動精子（%）　47.9±14.8　26.5±14.3*精子活動率（%）　68.6±10.7　42.2±12.7*精子正常形態率（%）　10.7±5.3　8.2±2.7精子DNA損傷率（%）　10.2±2.4　19.6±3.7*

二、精子DNA損傷程度與精子常規質量參數的關系

296例不育男性中，按精子DNA損傷程度（DNA損傷率＜25%，≥25%）分為兩組。與＜25%組比較，≥25%組中男方的前向運動精子率、正常形態率明顯降低（P＜0.05）；兩組之間年齡、精液量、精子濃度、精子總數、精子活動率也有一定差異，但無統計學意義（P＞0.05），（見表2）。

表2　精子DNA損傷程度與精子常規質量參數的關系

三、精子DNA碎片率與精子常規質量參數相關性分析

Spearman相關性分析結果顯示：精子 DNA 損傷率與男方年齡呈正相關；與前向運動精子率、正常形態率呈負相關（P＜0.05），（見表3）。

表3　精子DNA損傷率與精子常規質量參數相關性分析

討　論

精液常規檢查是傳統診斷男性不育第一參考指標，但有其局限性［4］。臨床研究發現：男性不育患者中有15%左右顯示精液常規質量參數正常。近年來，精子DNA損傷作為一項新的評價精子功能的指標，已逐漸應用于男性不育癥的診療和研究中。精子DNA損傷會引起精子功能和受精能力下降，導致不孕不育［5， 14］。

在精子形成過程中，染色質的核蛋白經歷了從組蛋白-過渡蛋白-魚精蛋白的轉變，以維持精子DNA的完整性。本實驗結果表明：與對照組相比，實驗組不育男性的精子DNA損傷率顯著升高，而前向運動精子率、精子活動率顯著降低（P＜0.05）。這與Rybar［6］、Blumer等［7］的報道相一致。當魚精蛋白合成缺陷或功能異常時，會造成精子染色質濃縮過程異常，形成結構松散的染色質，引起精子DNA損傷［8， 15］。而這一系列的改變會直接導致精子線粒體功能損傷，從而引起前向運動精子率減低，精子活力下降，引發男性不育［9］。另一方面，可能是由于精液中存在異常增多的白細胞可誘導精子產生過量的氧自由基，損傷精子膜的流動性和完整性，導致精子核DNA變性或斷裂，從而破壞精子功能［10］。綜上所述，精子DNA 損傷可使精子的運動能力下降，活力降低，影響精子與卵子的結合，最終導致不育。

此外，本研究還發現：當精子DNA損傷率≥25%時，前向運動精子率、正常形態率均明顯降低（P＜0.05）；且相關性分析顯示，精子DNA損傷率與前向運動精子率、正常形態率呈負相關。這首先可能是因為在未成熟精子和畸形精子的細胞核內含有大量的組蛋白，使得魚精蛋白含量降低，與DNA結合疏松，導致精子DNA損傷，活動率下降。其次，精子形態與氧化應激反應相關［11， 12］。精液中的畸形精子是過量活性氧的主要來源，它們引發的氧化應激反應可導致精子DNA完整性損傷進而產生更多的畸形精子，而這些畸形精子又會相應的加重精子DNA的損傷。兩者之間相互影響，形成惡性循環。

另外，本研究中顯示精子DNA損傷率與男性年齡呈正相關。這提示隨著年齡的增長，由于氧化應激或精子凋亡機制減退等原因，使得其自身無法有效清除DNA受損的精子［2， 13］。這可能是35歲以上男性生育能力逐漸下降的原因之一。

總之，精子DNA損傷檢測能夠揭示精子染色質濃縮程度和精子成熟度等細微異常。將其作為精液常規質量分析的補充，并結合其他精子功能指標，更能全面客觀地評估男性生育力，這將對男性不育的病因學及治療方法產生深遠的理論意義和臨床實用價值。

關鍵詞精子； DNA損傷； 精液常規； 不育，男性

doi∶10.3969/j.issn.1008-0848.2016.02.012

參 考 文 獻

1 Chen SS ， Huang WJ. Differences in biochemical markers

and body mass index between patients with and without varicocele. Chin Med Assoc 2010； 73（4）∶ 194-198

2曾蘭， 葉飛， 李運星， 等. 精子DNA完整性與精液常規參數相關性分析. 中國計劃生育和婦產科 2014； 6（4）∶ 47-50

3谷翊群， 陳振文， 盧文紅， 等. 人類精液檢查與處理實驗室手冊（第五版）. 北京∶ 人民衛生出版社， 2011∶ 10-35

4曹小蓉， 閆峰， 平萍， 等. 人類精子庫檔案信息管理系統及臨床應用. 中國男科學雜志 2011；25（12）∶38-41

5陳俊清， 羅勝萍， 黃誠剛. 精漿活性氧水平與男性不育的相關性研究. 國際檢驗醫學雜志 2011； 32（9）∶ 1002-1004

6Rybar R， Markova P， Veznik Z， et al. Sperm chromatin integrity in young men with no experiences of infertility and men from idiopathic infertility couples. Andrologia 2009； 41（3）∶ 141-149

7Blumer CG， Fariello RM， Restelli AE， et al. Sperm nuclear DNA fragmentation and mitochondrial activity in men with varicocele. Fertil Steril 2008； 90（5）∶ 1716-1722

8張歡， 鄭屹， 鄭九嘉， 等. 精子核蛋白組型轉換對精子DNA損傷程度和精液參數的影響. 中國男科學雜志2015； 24（6）∶ 24-29

9陸杉， 倪運萍， 劉娟， 等. 前向運動精子數量對男性因素不孕者宮腔內人工授精臨床妊娠率的影響. 重慶醫學2014； 23（8）∶ 2991-2993

10徐志鵬， 孫海翔， 張寧媛. 精子 DNA 損傷與輔助生殖技術. 中華男科學雜志 2008； 14（3）∶ 259-263

11張洲， 師娟子， 邢俊平， 等. 復發性流產與精液常規參數、精子畸形率和DNA完整性的相關性. 第三軍醫大學學報 2010； 32（16）∶ 1788-1792

12Hauser R， Meeker JD， Singh NP， et al. DNA damage in human sperm is related to urinary levels of phthalate monoester and oxidative metabolites. Hum Reprod 2007；22（3）∶ 688-695

13Sakkas D， Alvarez JG. Sperm DNA fragmentation∶mechanisms of origin， impact on reproductive outcome，and analysis. Fertil Steril 2010； 93（4）∶ 1027-1036

14Osman A， Alsomait H， Seshadri， et al. Does the extent of sperm DNA fragmentation affect IVF or ICSI outcome∶a systematic review and meta analysis. Hum Reprod 2013；28 （supp 1）∶ i9-i12

15谷龍杰， 陳振文， 許劍鋒. 不育男性精子染色質結構與精液常規參數的關系. 中國男科學雜志 2009； 23（3）∶ 29-32

（2015-08-10收稿）

*基金項目資助：重慶市科技攻關重點項目（cstc，2013ggB00001）；重慶市基本科研業務費項目（2013cstc-jbky-01707）

中圖分類號R 321.33

**通訊作者，E-mail：baohuaqiong@163.com