秦皇島近海褐潮高發區浮游植物的堿性磷酸酶活性分析

劉曉紅，覃仙玲，蔡陽揚，歐林堅，呂頌輝

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秦皇島近海褐潮高發區浮游植物的堿性磷酸酶活性分析

劉曉紅，覃仙玲，蔡陽揚，歐林堅，呂頌輝

（暨南大學赤潮與海洋生物學研究中心，水體富營養化與赤潮防治廣東普通高校重點實驗室，廣東 廣州510632）

摘要：堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AP）是浮游植物在磷脅迫狀態下表達的一種水解有機磷源的胞外酶，可用于指示海區浮游植物的磷脅迫狀態。本研究于 2013年 7月，對秦皇島近海抑食金球藻（Aureococcus anophagefferens）褐潮發生期間浮游植物的堿性磷酸酶活性（AP activity，APA）進行研究，結合其他理化參數，分析藻華發生時浮游植物的磷營養狀態及其對海水中磷源的水解與利用情況。結果表明，褐潮發生時，抑食金球藻細胞密度高達108個/L，溶解有機磷（Dissolved organic phosphorus，DOP）成為浮游植物生長利用的主要磷源。抑食金球藻的細胞密度受到海水中 NO3-、DOP、溶解無機磷（Dissolved inorganic phosphorus，DIP）濃度等的顯著影響。浮游植物大量表達AP水解DOP，平均APA高達217.72 nmol/（μg·h）±90.86 nmol/（μg·h）（350.44 nmol/（L·h）±130.57 nmol/（L·h）），且APA隨浮游植物生物量增大而顯著增加。該結果表明抑食金球藻褐潮發生時，海區遭受嚴峻的磷脅迫甚至限制。磷源，尤其是有機磷源的可利用性可能在秦皇島海區抑食金球藻褐潮的發生和維持中起關鍵作用。

關鍵詞：堿性磷酸酶； 抑食金球藻； 溶解有機磷； 秦皇島； 磷脅迫

［Foundation： Public science and technology research funds projects of ocean（201305003-2）； China NSF（U1301235； 41176087）］

2009年以來，在渤海灣的秦皇島近岸海域連續發生了抑食金球藻（Aureococcus anophagefferens）“褐潮”［1-2］。褐潮是繼赤潮和綠潮之后，我國出現的又一藻華新類型。秦皇島海域是中國扇貝養殖規模最大的區域之一，每當褐潮發生時，近海的養殖經濟和濱海旅游業都遭受重創［3-7］。

美國是最早發生抑食金球藻褐潮的國家［8-9］。有學者認為，海水中溶解有機氮濃度的升高是美國株抑食金球藻褐潮發生的關鍵因子之一［10-11］。褐潮主要在無機氮濃度較低有機氮濃度較高的條件下發生［12-14］。而近幾十年來，渤海海域的營養鹽結構已經由潛在的氮限制逐漸演變為現今的磷限制［15-16］。秦皇島抑食金球藻褐潮發生時，海區可能處于磷限制的環境中。在磷缺乏時，浮游植物可以通過表達堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）來利用溶解態有機磷（dissolved organic phosphorus，DOP）［17-18］。這種特性使堿性磷酸酶活性（AP activity，APA）可以作為浮游植物磷脅迫水平的指標［19-20］。因此，研究海區浮游植物的APA可以指示該海域浮游植物的磷營養生理狀態，并揭示其對DOP的水解利用能力。

本研究于2013年7月23～25日對秦皇島近海進行海上調查，重點研究抑食金球藻褐潮發生期間海區 APA水平，同時結合其他理化因子數據，分析褐潮發生期間浮游植物的磷營養生理狀態，揭示 DOP的生物可利用性，以期為秦皇島褐潮的暴發機制從營養生理學角度提供理論依據。

1　材料和方法

1.1采樣時間與站位

自2009年以來，秦皇島近海幾乎每年都暴發抑食金球藻褐潮，褐潮持續數十天至數月不等［3-7］。其中2013年發生的抑食金球藻藻華，為當年我國持續時間最長和單次過程影響面積最大的藻華，分別為98 d（5月25日～8月31日）和1 450 km2［6］。本次調查于2013年7月23～25日褐潮的高發持續期內，在秦皇島海域（119.44°～119.74°E； 39.71°～39.90°N）進行采樣，共采集4個斷面，每個斷面5個站位（圖1）。

圖1　秦皇島海域采樣站位圖Fig.1　Sampling stations in the Qinhuangdao coastal waters

1.2采樣與參數檢測

秦皇島近海海域水深較淺（<25 m），表底層海水混合較為均勻，故只采集表層海水進行實驗。海水使用有機玻璃采水器進行采集。水溫和鹽度由美國YSI 6600V2現場檢測，使用前用標準溶液對儀器的鹽度和溫度參數進行校正。采集的海水用150 μm孔徑篩絹去除大型浮游動物后，經GF/F濾膜過濾用于測定營養鹽。溶解態無機氮（dissolved inorganic nitrogen，DIN）、溶解態無機磷（dissolved inorganic phosphorus，DIP）、活性硅酸鹽（SiO32-）和溶解態有機磷（dissolved organic phosphorus，DOP）檢測按照國家《海洋調查規范》（GB/T12763-2007）［21］進行，其中 DIN=NO3-+ NO2-+ NH4+。抑食金球藻的密度采用流式細胞儀（BD，FACSCALIBUR）進行檢測，葉綠素a（Chl a）是將水樣過濾于 GF/F膜上，由葉綠素熒光儀（TURNER，Trilogy）測定。

APA的采樣是將水樣過濾于0.22 μm的醋酸纖維膜上并立即保存于液氮中，回到實驗室后，參考Hoppe［22］及Pettersson等［23］的方法進行測定。APA的表達單位采用單位水體 APA（單位： nmol/（L·h））與單位葉綠素 APA（單位： nmol/（μg·h））及單位細胞 APA（fmol/（個·h））表示。

1.3數據處理與分析

文中的數據分析均在統計學軟件 SPSS 13.0中進行，分布圖使用 Surfer 11軟件完成，主成分分析的軟件為Canoco 4.5。

2　結果

2.1理化環境因子

調查期間，秦皇島海域的溫度由北向南遞增，由近岸向外海遞減； 鹽度的分布趨勢剛好相反，近岸鹽度低，外海鹽度高。DIN、DIP、SiO32-均呈現出由近岸向外海減小的趨勢，平均值分別為 42.06 μmol/L± 22.39 μmol/L、0.15 μmol/L ± 0.11 μmol/L和34.3 μmol/L± 4.0 μmol/L（表 1）。無機態 DIN/DIP平均比值高達347.5±179.8，表明海區浮游植物處于磷脅迫甚至磷限制狀態。DOP濃度是DIP濃度的32.1±21.5倍，DOP是海區浮游植物可利用的主要磷源。

表1　秦皇島海域各理化環境因子的變化范圍與平均值Tab.1　Ranges and average values of different environmental parameters in the coastal waters of Qinhuangdao

2.2浮游植物豐度變化

Chl a在整個海域中變化范圍為0.88～3.09 μg/L，平均值為1.71 μg/L ± 0.57 μg/L（圖2）。靠北的兩個斷面Chl a濃度顯著高于南面的兩個斷面（P<0.05）。 抑食金球藻在整個研究海域的浮游植物群落中占絕對優勢，其密度分布趨勢為外海高于近岸，平均細胞密度高達10.64 個/L ± 5.59×107個/L。Chl a與抑食金球藻密度顯著正相關（P<0.05）。

2.3堿性磷酸酶活性

單位水體APA與單位Chl a APA（APAChl a）以及單位細胞 APA（APAcell）變化趨勢相似，均在最北的斷面具有最大平均值，且由近岸向外海逐漸增大，表明北部靠外海域的浮游植物遭受磷脅迫甚至限制較為嚴重（圖 3）。單位水體的 APA的平均值為350.44 nmol/（L·h）±130.57 nmol/（L·h），最高值出現在北部最靠外的站位，最大值為 534.01 nmol/（L·h）；APAChl a變化范圍為58.2～389.8 nmol/（μg·h），在最南部和最北部的兩條斷面出現高值。APAcell平均值為3.86 fmol/（個·h）± 2.06 fmol/（個·h）。

海域浮游植物的APA（包括單位水體APA與APAChl a以及 APAcell）與各理化環境因子之間相關性分析結果表明，單位水體 APA隨溫度的升高而顯著降低（P<0.01）；APAChl a隨DIP濃度的下降而顯著上升（P<0.05）。

圖2　秦皇島海域的葉綠素a與抑食金球藻密度分布Fig.2　The distribution of Chl a and cell densities of Aureococcus anophagefferens in the Qinhuangdao coastal waters

圖3　秦皇島海域的單位水體APA與單位葉綠素APA及單位細胞APA分布Fig.3　The distribution of APA and APAChl aand APAcellin the Qinhuangdao coastal waters

2.4抑食金球藻的密度與各理化環境因子的關系分析

對抑食金球藻的密度與海區各理化環境因子進行 PCA分析，結果表明，秦皇島海域抑食金球藻的細胞密度與溫度、鹽度、NO3-、DOP和DIP等因子呈正相關關系，與APAChl a、SiO32-和NH4+呈負相關（圖4）。

3　討論

圖4　抑食金球藻豐度（圖中AA表示）與理化環境因子的PCA二維排序圖Fig.4　Two-dimensional graph of PCA plot with Aureococcus anophagefferens richness（AA）and environmental factors

海水中的無機 N/P比常被用于指示水體可能存在的營養限制的情況，一般正常的N/P比值為 16︰1［24］，而當該比值大于20～30的時候，即意味著浮游植物處于磷限制狀態［25］。作者的研究結果表明2013 年 7月份，在秦皇島海域抑食金球藻褐潮暴發期間，海區DIP的平均濃度為0.15 μmol/L，DIN/DIP的比值平均為347.5，最高達769.7，遠遠超出了海水中正常的無機氮磷比值，說明海區浮游植物遭受嚴重的磷脅迫甚至磷限制。這與蔣紅等［15］對渤海近20年的營養鹽變化趨勢分析得出的結論是一致的； 他們提出了20世紀90年代與80年代相比，氮磷比值升高，渤海水域由氮限制逐步向磷限制方向演化。曹宇峰等［16］也進一步證明，渤海海域的N/P比已經由20世紀80年代初的2︰1～3︰1逐步上升到了2008年的67︰1，局部高達200︰1。2009年以來，秦皇島褐潮的暴發幾乎都是始于5月底6月初，7月份藻華密度持續升高，直至8月份才開始衰亡。在磷限制的條件下，抑食金球藻維持了長時間的藻華，除了具有細胞內部磷庫的支撐，還有可能通過表達AP水解DOP而獲得 PO43-。Wurch等［17］用蛋白質組學方法研究發現，抑食金球藻在磷缺乏條件下，AP的表達量會大量增長。而 Wurch等［18］認為在磷缺乏的條件下，抑食金球藻可以通過以下 4種途徑增強其對磷的利用或保存能力：（1）對5′-核苷酸酶及AP的正調控；（2）通過表達更多的磷轉運蛋白或者切換到更有效的磷轉運蛋白以增強其轉運磷的能力；（3）通過將磷脂質轉化成硫脂質以降低細胞的磷需求；（4）調整它的糖酵解途徑。這些研究都表明，抑食金球藻在磷限制條件下，具有表達AP以利用DOP的能力。

APAChl a與 PO43-濃度之間顯著負相關，APA的高值區主要集中在PO43-濃度小于0.20 μmol/L的站位，表明浮游植物在低磷下誘導表達AP，隨著褐潮生物量的增加，海區遭受的磷脅迫甚至磷限制加劇。調查過程中APAcell的平均值為3.86 fmol/（個·h）±2.06 fmol/（個·h），假設抑食金球藻的1天生長速率高達1，其單位細胞的最小顆粒磷含量為3.41 fmol/個（根據室內實驗結果假設），因此抑食金球藻細胞倍增的磷需求為0.14 fmol/（個·h）。由此可見，秦皇島褐潮發生期間，其 APA的水解速率遠遠大于磷需求。該海域中DOP占總磷的10.5%～98.6%，所以DOP在秦皇島褐潮發生期間，對浮游植物的磷補給上起重要的作用。

在秦皇島褐潮發生期間的單位APA與APAChl a水平約為同年4～5月東海調查海域的APA的5.70和1.85倍。經研究，東海海區也是一個磷限制海區，磷營養鹽含量和結構的變化可能在東海原甲藻藻華的發生中起重要作用［26-27］。而本次調查中由于實驗條件的限制，作者采集的秦皇島海域褐潮發生期的APA樣品是過濾到膜（孔徑 0.22 μm）上的生物樣品，因而檢測的主要是顆粒態的 APA，并不包含游離態APA。因此，作者推論，該海區褐潮發生時，整個水體中的APA水平可能還要更高。目前，對于抑食金球藻在中國得以發生褐潮的營養發生機理的研究基本處于空白。而美國株抑食金球藻褐潮的發生，則更多的強調氮源，尤其是有機氮源在褐潮發生中的作用。鑒于本文的研究結果，作者認為，磷源可能在中國株抑食金球藻褐潮的發生中發揮重要作用，研究有待深入開展。

4　結論

2013年7月，秦皇島抑食金球藻褐潮發生期間，海區的浮游植物處于嚴重的磷脅迫甚至限制狀態，隨藻華生物量的升高，浮游植物磷脅迫加劇。抑食金球藻的細胞密度與海水中NO3-、DIP和DOP正相關。DOP是海水中的主要可利用的磷源，抑食金球藻大量表達APA，迅速水解利用DOP。浮游植物對DOP的水解利用可能是褐潮得以發生和長時間維持的重要原因之一。

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（本文編輯： 張培新）

Alkaline phosphatase activity of phytoplankton in Qinhuangdao coastal waters with frequent brown tide occurrences

LIU Xiao-hong，QIN Xian-ling，CAI Yang-yang，OU Lin-jian，Lü Song-hui
（Research Center for Harmful Algae and Marine Biology/Key Laboratory of Eutrophication and Red Tide Prevention of Guangdong Higher Education Institutes，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

Received: Sept.25，2015

Key words:alkaline phosphatase； Aureococcus anophagefferens； dissolved organic phosphate； Qinhuangdao； phosphorus stress

Abstract:Alkaline phosphatase（AP）is a type of ectoenzyme that is expressed by phytoplankton under phosphorus（P）stress states and can hydrolyze dissolved organic P（DOP）.AP has been widely used to indicate the P stress status of phytoplankton in the sea.In this study，the AP activity（APA）of phytoplankton during the brown tide of Aureococcus anophagefferens that occurred near the coastal waters of Qinghuangdao was investigated in July 2013.The P status of phytoplankton and the capability of phytoplankton in using DOP during the bloom were analyzed.The results show that the density of A.anophagefferens was as high as 108cells/L when the bloom occurred in the coastal area of Qinhuangdao.DOP was the main P source for phytoplankton growth.The densities of A.anophagefferens showed positive correlations with NO3?，DOP，dissolved inorganic P，and so forth.Phytoplankton expressed abundant AP，and the average APA in water reached as high as 217.72 nmol/（μg·h）chla± 90.86 nmol/（μg·h）chla（350.44 nmol/（L·h）± 130.57 nmol/（L·h））.APA increased significantly with phytoplankton biomass.Our results suggest that A.anophagefferens experienced severe P stress or even P limitation when the brown tide occurred.The bioavailability of P，particularly DOP，may play a key role in the occurrence and persistence of the brown tide of A.anophagefferens in the coastal waters of Qinhuangdao.

中圖分類號：P735

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3096（2016）03-0095-06

doi：10.11759/hykx20150925001

收稿日期：2015-09-25； 修回日期： 2015-12-09

基金項目：海洋公益性行業科研專項經費資助項目（201305003-2）； 國家自然科學基金項目（U1301235； 41176087）

作者簡介：劉曉紅（1990-），女，山東臨沂人，碩士研究生，主要從事海洋微藻的生理生態學研究，E-mail： yueer2596@163.com，電話：020-85221562； 歐林堅，通信作者，E-mail： torangeou@jnu.edu.cn