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飼料中添加兩株乳酸菌及其發酵上清液對凡納濱對蝦消化酶活性的影響

2016-07-11 08:54:26沙玉杰孫國瓊王寶杰
海洋科學 2016年3期

沙玉杰,王 雷,孫國瓊,劉 梅,王寶杰

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飼料中添加兩株乳酸菌及其發酵上清液對凡納濱對蝦消化酶活性的影響

沙玉杰1,2,3,王雷1,2,孫國瓊1,2,劉梅1,2,王寶杰1,2

(1.中國科學院 海洋研究所 海洋生物學重點實驗室,山東 青島 266071; 2.青島海洋科學與技術國家實驗室海洋生物學與生物技術功能實驗室,山東 青島 266237; 3.中國科學院大學,北京 100049)

摘要:為了探討前期實驗獲得的益生菌及其發酵上清液對凡納濱對蝦消化功能的影響,將初始體質量3.5 g ± 0.06 g的凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)在30℃± 2℃環境下于水族箱中養殖4周。以基礎飼料為對照組,在基礎飼料中分別添加戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)HC-2、糞腸球菌(Enterococcus faecium)NRW- 2、戊糖乳桿菌HC-2的發酵上清液,最終每克基礎飼料中含有1.0×107 CFU益生菌或此菌量所對應的發酵上清液,共配制3組實驗飼料。實驗結果如下: 與對照組相比,各實驗組對蝦腸道中蛋白酶活力顯著提高(P<0.05),但肝胰腺中蛋白酶活力無顯著差異; 添加 NRW-2的實驗組與對照組相比,腸道和肝胰腺中淀粉酶和脂肪酶活力均顯著提高(P<0.05),HC-2組對蝦肝胰腺中淀粉酶及腸道中脂肪酶的活力顯著提高(P<0.05),而HC-2發酵上清液的添加僅顯著提高了對蝦腸道蛋白酶和淀粉酶的活性。結果表明飼料中添加 NRW-2、HC-2及其發酵上清液可以提高凡納濱對蝦腸道及肝胰腺中消化酶的活力,但在不同組織中提高消化酶活性的種類是不同的,為水產養殖安全投入品的開發及乳酸菌在水產養殖中的推廣應用提供一定的科學依據。

關鍵詞:戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)HC-2; 糞腸球菌(Enterococcus faecium)NRW-2; 凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei); 消化酶活性

[Foundation: The National Key Technology R&D Program of China,No.2012BAD17B03]

凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei),原產于南美洲太平洋沿岸,因其具有生長周期短、抗病力強、對水環境適應力強等優點,在中國得到了迅速推廣[1]。然而在對蝦養殖中,由于病害泛濫給對蝦養殖業造成了巨大損失[2]。但是目前尚無有效的治療措施,主要以預防為主,其中采用益生菌提高對蝦的生理健康水平和清潔養殖環境已成為預防病害的重要措施。

益生菌是一類對宿主有益的活性微生物,其對水產動物有諸多有利影響,如拮抗病原菌、與病原菌競爭粘附位點和營養以及提高宿主免疫力等[3-4]。乳酸菌是一種被廣泛應用的益生菌,其在畜禽養殖的研究應用較多,研究表明其可以增強畜禽的免疫力、調節腸道微生物菌群平衡、分泌抑菌物質如乙酸、乳酸和細菌素及提高畜禽的成活率和日增重等[5-12]。近年來,乳酸菌如短乳桿菌(Lactobacillus breris)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)及植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)等也被廣泛的應用于水產中以提高水產動物的免疫機能及生長性能[13]。但這些菌株大部分來自于畜禽,考慮到水陸兩類動物生活習性的迥然差異,作者自水產動物中分離得到兩株乳酸菌: 戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)和糞腸球菌(Enterococcus faecium),前期實驗結果說明兩株菌具有促進對蝦生長的作用。

本實驗研究了飼料中添加水生動物來源的糞腸球菌、戊糖乳桿菌及其發酵上清液對凡納濱對蝦消化酶活性的影響,探討了益生菌及其代謝產物對凡納濱對蝦消化酶的調節作用,以期為水產養殖安全投入品的開發及乳酸菌在水產養殖中的推廣應用提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料

實驗菌株: 糞腸球菌 NRW-2和戊糖乳桿菌HC-2均分離自健康的矛尾刺蝦虎魚(Acanthogobius hasta),預研究發現 NRW-2對凡納濱對蝦腸道粗黏液具有較好的黏附性,而 HC-2對副溶血弧菌ATCC17802具有較強的抑菌活性。兩株菌分別接種于MRS液體培養基在37℃條件下靜置培養24 h后,對發酵液進行離心(12 000 r/min,10 min),保留HC-2上清液備用,菌體用無菌海水洗滌 3次后重懸于無菌海水中備用。

健康的凡納濱對蝦由青島瑞茲海珍品發展有限公司提供,1 200只對蝦平均分配于12個水族箱(640 L/個)暫養馴化1周,暫養期間每天飼喂3次基礎日糧。所有對蝦均飼養于海水中(鹽度30),溫度為(30 ± 2)℃,持續通氣,每天日換水量為60%。飼料每日投喂量為對蝦體質量的10%,投喂時間分別為7: 00,11: 00 和 19: 00,投喂量分別占每日投喂量的35%,20% 和 45%。馴化期(7 d)結束后,每個水族箱中凡納濱對蝦的平均體質量約為3.5 g。

基礎飼料為煙臺大樂飼料有限公司生產的南美白對蝦飼料 1#料,粗蛋白 42%,粗脂肪 7%,灰分15%,水分11%。

1.2實驗設計

將12個水族箱隨機分成4組(3個實驗組,1個對照組),每組3個重復,每個重復90只蝦。實驗組1:基礎飼料中含有戊糖乳桿菌活菌(1×107CFU/g飼料);實驗組 2: 對蝦投喂的基礎飼料中含有糞腸球菌活菌(1×107CFU/g飼料); 實驗組3: 對蝦投喂的飼料中含有戊糖乳桿菌的上清液(對應每克飼料中含有1×107CFU戊糖乳桿菌上清液的量); 對照組只投喂基礎飼料。養殖周期為 4周。飼養條件與馴化時期一致。

1.3樣品處理

實驗結束后,自12個水族箱中分別隨機選取20只對蝦,用 75%酒精對其表面消毒后進行解剖,分別取其肝胰腺和腸道,去除腸道的內容物并且在濾紙上將表面的水分吸干,每個樣品均為20只對蝦的混樣,所有操作均在冰浴中進行。

分別稱取 1 g腸道及肝胰腺樣品置于預冷的勻漿器,并加入 4倍體積預冷的磷酸緩沖液(pH7.4)勻漿,隨后12 000 r/min、4℃離心10 min,留上清,4℃儲存,樣品在24 h之內測定,每組樣品3個平行。

1.4消化酶測定

蛋白酶活力測定采用Rathore[14]的方法進行,在此條件下水解底物偶氮酪蛋白,將每分鐘 OD值增加0.001所需的酶量定義為一個酶活單位。

淀粉酶活力測定參照黃凱等[15]的淀粉酶測定方法。在 25℃下,每分鐘每毫升淀粉酶將可溶性淀粉降解成麥芽糖,麥芽糖含量每升高1 μg作為1個酶活單位。

脂肪酶活力測定參照 Aryee等[16]的方法進行,在 25℃條件下,催化對硝基苯酚每分鐘 OD值增加0.01所需酶量定義為一個酶活單位。

各種酶活力以比活力進行表示,即每毫克可溶性蛋白所含酶活單位數(U/mg)。蛋白質濃度采用考馬斯亮藍G-250法測定。

1.5數據分析

所有數據由 SPSS 17.0軟件進行單因素方差和LSD多重比較分析,顯著水平P值采用0.05。

2 結果

2.1飼料中添加 NRW-2、HC-2及其發酵

上清液對凡納濱對蝦蛋白酶活力的影響

實驗結果表明,與對照組相比,飼料中添加NRW-2、HC-2及其發酵上清液顯著提高了凡納濱對蝦腸道中蛋白酶的活力,其中 NRW-2處理組的蛋白酶活力最高,并且顯著高于其他兩個處理組(P<0.05); 凡納濱對蝦肝胰腺中蛋白酶活力在 3個處理組中雖然有不同程度的提高,但與對照組相比差異不顯著,并且 3個處理組之間也沒有顯著差異(圖1)。

2.2飼料中添加 NRW-2、HC-2及其發酵上清液對凡納濱對蝦淀粉酶活力的影響

由圖 2可見,HC-2(S)處理組與對照組相比,其對蝦腸道中淀粉酶活力顯著提高(P < 0.05),但是與NRW-2處理組相比沒有顯著差異,并且 HC-2及NRW-2處理組對凡納濱對蝦腸道淀粉酶活性的影響與對照組相比均不顯著; 與對照組相比,HC-2和NRW-2處理組對蝦肝胰腺中淀粉酶活力顯著提高(P<0.05),而 HC-2(S)處理組對蝦肝胰腺中淀粉酶活力與對照組相比差異不顯著。

圖1 飼料中添加NRW-2、HC-2及其發酵上清液對凡納濱對蝦腸道和肝胰腺蛋白酶活力的影響Fig.1 Effects of probiotics and the corresponding supernatant on protease activities in the intestine and hepatopancreas of Litopenaeus vannamei

HC-2.戊糖乳桿菌HC-2; NRW-2.糞腸球菌NRW-2; HC-2(S).戊糖乳桿菌HC-2上清液

HC-2,NRW-2,and HC-2(S)represent Lactobacillus pentosus HC-2,Enterococcus faecium NRW-2,and the supernatant of L.pentosus HC-2,respectively

圖2 飼料中添加NRW-2、HC-2及其發酵上清液對凡納濱對蝦腸道和肝胰腺淀粉酶活力的影響Fig.2 Effects of probiotics and the corresponding supernatant on amylase activities in the intestine and hepatopancreas of Litopenaeus vannamei

2.3飼料中添加 NRW-2、HC-2及其發酵上清液對凡納濱對蝦脂肪酶活力的影響

由圖3可見,HC-2處理組與NRW-2處理組對蝦腸道脂肪酶的活性顯著高于對照組(P<0.05),其中HC-2處理組的脂肪酶活力最高且顯著高于 NRW-2處理組,而HC-2(S)處理組與對照組相比反而抑制了凡納濱對蝦腸道中脂肪酶活力; NRW-2處理組與對照組相比對蝦肝胰腺脂肪酶活力顯著提高(P<0.05),HC-2處理組和 HC-2(S)處理組與對照組相比雖然提高了脂肪酶活力,但差異不顯著。

3 討論

消化酶(蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等)在營養物質分解中發揮著重要作用。蛋白酶是水解蛋白質肽鏈一類酶的總稱,可以將蛋白質分解為利于機體吸收的氨基酸; 淀粉酶和脂肪酶則分別降解碳水化合物和脂肪,最終生成的單體及能量供給機體生長及發育。動物的消化器官對飼料組成具有較高的敏感性,進而調節體內消化酶的活性,最終影響動物的生理狀態[17-18]。

本實驗中,NRW-2和HC-2的添加顯著提高了凡納濱對蝦腸道中蛋白酶和脂肪酶活力,但均未顯著提高淀粉酶活力,其中HC-2的添加對淀粉酶活力反而出現了一定的抑制作用。Ye等[19]發現飼料中添加益生菌或者益生元可以增強腸道中蛋白酶和淀粉酶的活性,其中對蛋白酶的作用優于淀粉酶,而王彥波等[20]的研究報告證實復合益生菌的添加顯著提高了凡納濱對蝦腸道中蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活力,與本實驗的結果不完全一致,這可能是由于所采用的菌株種類與搭配不同所致。動物腸道中消化酶的活性受到諸多因素的影響,如溫度、鹽度、pH及腸道菌群等[21]。細菌具有分泌一系列胞外酶的特性,乳酸菌也不例外[22],但經過預實驗本實驗所用的糞腸球菌NRW-2和戊糖乳桿菌HC-2均無分泌可檢測到的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶,因此本實驗中的實驗結果可能與糞腸球菌和戊糖乳桿菌的加入影響了對蝦腸道的 pH或原腸道菌群中參與分泌消化酶及影響消化酶活性的微生物有關,但是此猜測還需要實驗的進一步驗證。

肝胰腺作為對蝦消化系統中的重要器官,是眾多生物大分子的主要合成場所,在對蝦代謝上發揮著重要作用[23]。本實驗中HC-2處理組顯著提高了對蝦肝胰腺中淀粉酶活力,而NRW-2處理組顯著提高了對蝦肝胰腺中淀粉酶和脂肪酶活力,但兩者均未顯著提高蛋白酶活力,此結果與 Sun等[24]研究的結果截然相反,其研究顯示乳酸菌的加入顯著提高了斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)肝胰腺中蛋白酶活力,但對肝胰腺中淀粉酶和脂肪酶活力沒有顯著差異,并且Liu等[25]研究結果顯示,飼料中芽孢桿菌的添加也沒有顯著提高凡納濱對蝦肝胰腺中蛋白酶活力,甚至隨著菌量的增加而出現不同程度的抑制作用。這說明益生菌對機體消化酶活性的影響是各異的,與菌種本身表面成分及代謝有關,同樣也與水生動物有關,如食性、環境條件、個體發育的不同階段[26]及機體自身代謝需求等。

由于戊糖乳桿菌HC-2具有較強的抑菌作用,本實驗將其活菌與發酵液分離后分別探討它們的添加對凡納濱對蝦消化酶活性的影響。結果表明戊糖乳桿菌 HC-2上清液的添加提高了凡納濱對蝦腸道中蛋白酶和淀粉酶活力,對腸道中脂肪酶和肝胰腺中蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力均沒有顯著差異; 而戊糖乳桿菌 HC-2菌體的添加顯著提高了凡納濱對蝦腸道及肝胰腺中3種消化酶活力; 此外,前期實驗顯示戊糖乳桿菌 HC-2菌體的添加顯著提高了凡納濱對蝦的特定生長率,而HC-2菌株發酵上清液實驗組的特定生長率低于對照組(P>0.05),因此推測益生菌菌體在此菌量的情況下對機體的益生效果或許優于其發酵上清液。本實驗就水生動物來源的兩株乳酸菌及其發酵上清液對凡納濱對蝦消化酶活性影響的探討,期望為水產養殖安全投入品的開發及乳酸菌在水產養殖的推廣應用提供一定的科學依據。

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(本文編輯: 譚雪靜)

Effects of two lactic acid bacteria species and the corresponding supernatants on the activities of digestive enzymes in Litopenaeus vannamei

SHA Yu-jie1,2,3,WANG Lei1,2,SUN Guo-qiong1,2,LIU Mei1,2,WANG Bao-jie1,2
(1.Key Laboratory of Experimental Marine Biology,Institute of Oceanology,Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266071,China; 2.Laboratory for Marine Biology and Biotechnology,Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology,Qingdao 266237,China; 3.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China)

Received: Apr.27,2015

Key words:Lactobacillus pentosus HC-2; Enterococcus faecium NRW-2; Litopenaeus vannamei; digestive enzyme

Abstract:To investigate the effects of probiotics and the corresponding supernatants on the activities of digestive enzymes in Litopenaeus vannamei,several groups of L.vannamei(approximately 3.5 g)were reared at a temperature of 30 ± 2°C in an aquaria for 4 weeks.The following four trials(three treated and one control)were conducted:T1,shrimp fed with a commercial diet + strain Lactobacillus pentosus HC-2(1×107CFU/g feed); T2,shrimp fed with a commercial diet + strain Enterococcus faecium NRW-2(1×107-CFU/g feed); T3,shrimp fed with a commercial diet + the supernatant of strain L.pentosus HC-2(the corresponding supernatant of 1×107CFU/g feed of L.pentosus HC-2); and T4,shrimp fed with a commercial diet alone as a control.The results demonstrated that the protease activities were significantly(P<0.05)increased in the intestines of three treatment groups compared with those in the control group,but they were not significantly increased in the hepatopancreas.The amylase and lipase activities were significantly(P<0.05)increased in the intestines and hepatopancreas of shrimp fed with E.faecium NRW-2 compared with those in the control group.The amylase and lipase activities were significantly(P<0.05)increased in the hepatopancreas and intestines,respectively,in the group of shrimp fed with L.pentosus HC-2,whereas the protease and amylase activities were just increased significantly in the intestines of shrimp fed with the supernatant of L.pentosus HC-2.This study suggested that the activities of digestive enzymes in L.vannamei can increase by NRW-2,HC-2,and the corresponding supernatant but vary in different tissues.These results provide a solid foundation for the application of probiotics in aquaculture.

中圖分類號:S963.73+9

文獻標識碼:A

文章編號:1000-3096(2016)03-0059-06

doi:10.11759//hykx20150427001

收稿日期:2015-04-27; 修回日期: 2015-10-22

基金項目:國家科技支撐計劃(2012BAD17B03)

作者簡介:沙玉杰(1989-),女,山東德州人,博士研究生,主要從事水生動物微生態制劑的研究與開發,電話: 0532-82898723,E-mail:syjlw89@163.com; 王寶杰,通信作者,電話: 0532-82898722,E-mail:wangbaojie@qdio.ac.cn

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