薄荷醇對仿刺參幼參的麻醉效果

韓　莎，胡　煒，李成林，趙　斌，嚴　芳

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薄荷醇對仿刺參幼參的麻醉效果

韓莎，胡煒，李成林，趙斌，嚴芳

（山東省海洋生物研究院，山東 青島 266104）

摘要：為確立一種準確測量仿刺參體長的方法，選用薄荷醇（menthol）為麻醉劑，在不同麻醉濃度條件下，觀察了對仿刺參（Apostichopus japonicus）幼參的麻醉反應，同時比較了在不同水溫（11、13、15、17、19、21℃）環境條件下對不同規格（（L）42.37 g±1.99 g、（M）22.91 g±1.03 g、（S）12.09 g±1.51g）幼參的麻醉效果。結果顯示： 當薄荷醇濃度在4%以內時對仿刺參具有良好的麻醉效果，麻醉起效迅速，復蘇率為100%； 在麻醉體積分數為0.25%、0.5%、1%時，對大規格幼參麻醉時間及復蘇時間影響顯著，而對中小規格影響不顯著； 水溫11～19℃時，隨著溫度的升高，仿刺參幼參的麻醉時間從15.62 min±1.31 min縮短到12.17 min±0.21 min，但復蘇時間從13.61 min±4.85 min顯著增加到28.10 min±7.35 min，不同水溫下薄荷醇對仿刺參幼參的麻醉效果差異顯著（P<0.05），當水溫超過 21℃時幼參麻醉狀態出現異常，不適宜進行麻醉。研究表明： 薄荷醇是一種對仿刺參安全有效的麻醉劑，在水溫11～21℃進行測量體長的實驗中，對體質量20 g以上的幼參適宜的麻醉體積分數為0.5%～1%，對體質量20 g以下的幼參適宜的麻醉體積分數為0.25%～0.5%。

關鍵詞：仿刺參（Apostichopus japonicus）； 薄荷醇； 麻醉； 溫度

［Foundation： Agriculture Seed Project of Shandong Province，No.2014-2016； Science and Technology Development Project of Shandong Province，No.2014GNC111022； Oceanic Research Special Funds for Public Welfare Projects of State Oceanic Administration，No.201305001-4；Sea cucumber Innovation Team of Shandong Agriculture Research System，No.SDAIT- 08-011-01； AgriculturalScience and Technology Achievement Transformation Project of Shandong Province］

仿刺參（Apostichopus japonicus）養殖產業已成為繼海帶、對蝦、扇貝及海水魚類養殖之后的第五次海水養殖產業浪潮［1］，近年來隨著養殖規模的不斷擴展，系統開展仿刺參遺傳育種研究已成為當前人們的關注熱點以及產業發展的重點。在仿刺參選育以及實際生產中，體長與體質量的準確定量是進行育種與生產的關鍵指標參數，但因仿刺參具有獨特的生理生態學特性，其體長與體質量易受環境因素的影響，且變化較大，為其體長的準確測量帶來很大困難，至今尚未形成有關仿刺參體長測量的統一標準。麻醉可以使仿刺參短暫的保持靜止，達到減小誤差、準確測量體長的目的。因此，有學者開始嘗試運用麻醉的方法進行仿刺參體長的準確測量。目前，相關麻醉方法的研究主要集中在魚蝦貝等水產生物［2-6］，麻醉劑多選用MS-222、丁香酚、2-苯氧乙醇、苯佐卡因和乙二醇苯醚等，而有關海參麻醉方法的研究較少，僅有以硫酸鎂［7-8］、丁香酚［8］、乙二醇苯醚［8］和薄荷醇［9］進行仿刺參體長測量的相關實驗研究。同時，麻醉劑的麻醉效果受多種因素的影響，其中，種類、體重和溫度是影響麻醉效果的重要因素，目前對仿刺參麻醉效果的影響因素的相關研究仍鮮有報道。

薄荷醇（menthol），又名薄荷腦，化學名： 5-甲基-2-異丙基-環己醇，有抑制中樞系統、止痛鎮靜等作用［10］， 被美國 FDA視為安全無副作用的麻醉藥物，具有悠久的藥用歷史［11］，廣泛應用在醫藥（局部麻醉劑、鎮痛膏）、食品等行業。作為水產麻醉劑已應用在多毛類［12］、雙殼類［13］及腔腸類［14］，在海參類如仿刺參A.japonicus成參［9］和糙海參H.scabra幼參［15］也有應用研究，但尚未見有關仿刺參幼參麻醉效果的研究報道。本研究使用薄荷醇對不同規格的仿刺參幼參進行了麻醉試驗，比較分析了不同濃度的薄荷醇以及不同水溫條件對仿刺參幼參的麻醉效果，旨在為薄荷醇應用于仿刺參的麻醉和體長的準確測量提供可靠的技術方法和基礎理論依據。

1　材料與方法

1.1實驗材料

選取本實驗室培育的表觀正常、肉刺堅挺、健康活力強的仿刺參，按平均體質量分為大規格（L）42.37 g±1.99 g、中規格（M）22.91 g±1.03 g、小規格（S）12.09 g±1.51 g共3種規格，分別暫養于有效水體0.2 m3的玻璃鋼槽中，每個玻璃鋼槽中放置 20～ 40頭，24 h連續微量充氣，每天15： 00定時按體質量5%～8%投喂配合飼料，投飼后停止充氣1 h。日換水2/3，3 d全量換水一次，并清理殘餌和糞便。實驗海水為經過沙濾的自然海水，鹽度33，pH8.2，DO>6 mg/L。

1.2實驗方法

1.2.1麻醉劑的配制

將薄荷醇晶體0.56 g溶解于100 mL無水乙醇中配制成母液，然后按實驗設計加入過濾海水配制成不同體積濃度的薄荷醇海水溶液作為麻醉液。

1.2.2仿刺參安全有效麻醉體積分數的篩選

設置0.1%、0.25%、0.5%、1%、2%、4%、6%、8%、10%共9個薄荷醇體積分數梯度，每個梯度組選用10頭中規格仿刺參進行試驗，在實驗前24 h停止喂食，麻醉前20 min將其撈出放入解剖盤中瀝水20 min，使其自然排出體腔內的水分，然后放入20 L的塑料整理箱中進行麻醉，薄荷醇麻醉液體積為10 L。當仿刺參身體不再伸縮，保持靜止，口周圍觸手完全舒展，刺激時身體和口周圍觸手均無伸縮反應時即達到麻醉狀態。仿刺參達到麻醉狀態后即可對其進行體長的測量，之后將體表沖洗干凈并放入潔凈的海水中進行復蘇，當仿刺參口周圍觸手收縮至自然狀態，開始正常活動爬行時即達到復蘇狀態［8］。觀察仿刺參在麻醉及復蘇過程中的行為特征以及體表的變化，并記錄達到麻醉和復蘇的時間，確定薄荷醇對仿刺參安全有效的麻醉體積分數范圍。

1.2.3濃度梯度的設置

根據篩選的安全有效的麻醉濃度，隨機選取 3種規格仿刺參各6頭，在15℃±0.2℃水溫下，分別放入體積分數為 0.25%、0.5%、1%的薄荷醇海水溶液中進行麻醉，并設3個平行組，記錄麻醉和復蘇時間。

1.2.4溫度梯度的設置

根據不同濃度薄荷醇對仿刺參的麻醉效果，選取體積分數為0.5%的薄荷醇海水溶液。隨機選取中規格仿刺參各 6頭，分別在 11、13、15、17、19、21℃的6個水溫梯度下進行麻醉實驗，設3個平行組，記錄麻醉和復蘇的時間。

1.2.5仿刺參體長的測量

實驗前隨機選取仿刺參10頭，對選取的仿刺參進行體長的測量，重復測量 5次并記錄測量數據作為對照組，然后將仿刺參放入體積分數為 0.5%的薄荷醇中進行麻醉，達到麻醉狀態時取出進行體長的測量，重復測量5次并記錄測量數據作為麻醉組，每次測量前重新將仿刺參放入麻醉液中浸浴 5 min后再進行測量。最后統計體長的變異系數CV，CV計算公式如下：

式中，SD為標準偏差，Mean為平均值。

1.2.6數據分析

實驗數據采用 spss軟件進行統計分析，統計值均用平均值±標準差表示（Mean±SD），以P<0.05表示差異顯著。

2　結果

2.1不同體積分數薄荷醇對仿刺參幼參的麻醉反應及效果篩選

不同體積分數的薄荷醇對仿刺參的麻醉反應見表1。通過各體積分數組對仿刺參幼參的麻醉反應觀察發現，薄荷醇的麻醉效果與體積分數成正相關。在薄荷醇體積分數為0.1%時，仿刺參麻醉1h仍達不到麻醉效果； 當體積分數為0.25%～5%時，對仿刺參麻醉效果較好，表現在 40 min內可達到麻醉狀態，在麻醉過程中仿刺參棘堅挺，身體受刺激不斷伸縮舒展，口周圍觸手完全舒展，而且經復蘇1 h之內幼參可進行正常的活動，活力較好，無異常現象。當體積分數低于4%時，復蘇率為100%； 當體積分數為5%時，復蘇率降到 90%； 當體積分數為 6%～10%時，麻醉效果較差，在麻醉和復蘇過程中仿刺參出現不同程度的異常現象，具體表現在麻醉過程中身體蜷縮，棘有不同程度的收縮，口周圍觸手不完全舒展，并伴隨麻醉濃度的增大，棘逐漸由鈍圓變得平滑，口周圍觸手呈現完全不舒展緊閉的狀態，而且出現該現象的個體逐漸增多，在復蘇過程中仿刺參活力較差，個別個體棘逐漸出現化皮的現象； 當體積分數達到 10%時，除上述現象外，體表還出現大面積的褪色，而復蘇后仿刺參活動遲緩，棘柔軟不堅挺，棘及體表出現不同程度的化皮現象，部分幼參身體僵硬，形態固定，隨著復蘇時間的延長也難以恢復到正常狀態。結果顯示，在 0.25%～4%的體積分數時，仿刺參幼參能夠較快地達到麻醉狀態，且在短時間內復蘇達到良好的自然狀況，能夠正常攝食并保持較好的活力，是安全有效的麻醉體積分數。

表1　不同體積分數薄荷醇對仿刺參的麻醉反應Tab.1　Characteristic anesthetic behaviors of menthol in different concentrations for Apostichopus japonicus

2.2不同體積分數薄荷醇對仿刺參幼參的麻醉效果

不同規格仿刺參麻醉和復蘇所需的時間如圖1和圖2所示。當薄荷醇體積分數為0.25%時，小規格仿刺參麻醉時間為 13.34 min±3.02 min，復蘇時間為 9.18 min± 1.77 min； 中規格仿刺參麻醉時間為 24.83 min± 5.96min，復蘇時間為6.76 min±4.84min； 大規格仿刺參麻醉時間為26.90 min±5.09 min，復蘇時間為

圖1　不同體積分數的薄荷醇對仿刺參麻醉時間的影響Fig.1　The effect of menthol in different concentrations on duration of anesthesia for Apostichopus japonicus

圖中不同字母表示麻醉時間存在顯著差異

Different letters indicate significant differences in the duration of anesthesia

圖2　不同體積分數的薄荷醇對仿刺參復蘇時間的影響Fig.2　The effect of menthol in different concentrations on recovery time for Apostichopus japonicus

圖中不同字母表示復蘇時間存在顯著差異

Different letters indicate that there is a significant difference in recovery time

8.23 min±4.04 min。當薄荷醇體積分數為0.5%時，小規格仿刺參麻醉時間為10.74 min±3.02 min，復蘇時間為13.78 min±3.41 min； 中規格仿刺參麻醉時間為19.06 min±4.85 min，復蘇時間為6.24 min±3.65 min；大規格仿刺參麻醉時間為18.67 min±2.61 min，復蘇時間為21.41 min±5.09 min。當薄荷醇體積分數為1%時，小規格仿刺參麻醉時間為 7.58 min±4.32 min，復蘇時間為15.81 min±4.24 min； 中規格仿刺參麻醉時間為12.84 min±6.26 min，復蘇時間為9.67 min±6.98 min；大規格仿刺參麻醉時間為13.34 min±2.61 min，復蘇時間為28.17 min±4.9 min。

結果顯示，在相同水溫條件下，隨薄荷醇體積分數的升高，3種規格的仿刺參麻醉所需時間表現出縮短的趨勢，而復蘇所需時間表現出增加的趨勢。但不同規格的變化幅度不同，規格越大的仿刺參，受麻醉濃度的影響越大，變化幅度亦越大。在相同麻醉體積分數條件下，規格越大的仿刺參麻醉所需時間越長，復蘇所需時間也相應的延長，不同體積分數組對大規格幼參麻醉及復蘇時間影響顯著（P<0.05），而對中小規格不顯著。薄荷醇體積分數及仿刺參規格對麻醉及復蘇所需時間均有顯著影響。

2.3不同水溫下薄荷醇對仿刺參幼參的麻醉效果

不同水溫下薄荷醇對仿刺參麻醉和復蘇的效果?如圖3所示。在水溫11℃時，麻醉時間為15.62 min± 1.31 min，復蘇時間為 13.61 min±4.85 min； 在水溫13℃時，麻醉時間為13.84 min±0.87 min，復蘇時間為13.07 min±6.26 min； 在水溫15℃時，麻醉時間為14.74 min±1.02 min，復蘇時間為8.48 min±?3.54 min；在水溫17℃時，麻醉時間14.11 min±0.65 min，復蘇時間為 12.13 min±8.39 min； 在水溫 19℃時，麻醉時間12.17 min±0.21 min，復蘇時間為28.10 min±?7.35 min。實驗中觀察發現，在 19℃水溫組中有極個別仿刺參幼參出現棘收縮的現象，在水溫 21℃時，仿刺參麻醉或者復蘇的實驗狀態均有別于其他水溫段，身體蜷縮不舒展，棘也收縮，口周圍觸手完全不伸展，身體min±9.44 min。從圖3可以看出，水溫為11～19℃時，隨著溫度的升高，仿刺參麻醉所需時間從 15.62?min±1.31 min縮短到12.17min±0.21 min，差異不顯著（P>0.05），但復蘇時間明顯增加，從13.61min±4.85 min增加到28.10min± 7.35 min，差異顯著（P<0.05）。其中，15?℃溫度組的復蘇時間最短，為8.48±3.54 min。不同水溫下相同體積分數的薄荷醇對仿刺參麻醉效果有顯著差異（P<0.05）。

圖3　不同溫度下薄荷醇對仿刺參的麻醉效果Fig.3　The anesthetic effect of menthol on Apostichopus japonicus at different temperatures

水溫21℃下無麻醉時間

Water temperature 21℃ without anesthesia time

2.4麻醉對仿刺參體長的影響

仿刺參的體長在麻醉前后重復測量 5次的結果如表2所示。對照組體長測量值較為分散，測量差值（最大值與最小值之差）為 9～29 mm（18.9 mm±9.5 mm，n=10），cv為5.2%～18.9%； 麻醉組測量值趨于相對集中穩定的趨勢，測量差值為4～8 mm（6.3 mm±2.9 mm，n=10），cv降低到1.6%～3.1%。統計結果顯示，麻醉前后cv從10.9%下降到2.4%，體長的平均值從73.5 mm± 15.3 mm增加到80.8 mm±12.9 mm，麻醉前后仿刺參體長的測量結果有顯著性差異（P<0.05）。

表2　仿刺參麻醉前后體長的變化Tab.2　The measurement of Apostichopus japonicus body length before and after anesthetization

3　討論

3.1不同體積分數薄荷醇對仿刺參的麻醉效果在水產養殖實際生產和科學研究中，尤其是在進行運輸、采卵、授精、標志及稱量等操作過程時，為降低對水產動物的應激反應，避免對水產動物造成傷害，麻醉劑的使用越來越廣泛，不同物種所適用的麻醉劑有所不同，尤其是仿刺參在不良環境下或者受到在較大刺激時極易發生排臟或化皮等應激反應，因此對麻醉藥物的選擇有所局限。魚蝦類常用的麻醉劑如丁香酚、乙二醇苯醚等對仿刺參傷害較大，易出現吐腸、化皮及褪色等現象，麻醉效果不理想，不適宜作為仿刺參麻醉劑，而硫酸鎂麻醉效果較好，但適宜麻醉的體積分數范圍較窄，為0.3～0.4 mol/L，且復蘇到正常狀態所需時間相對較長。有研究表明，薄荷醇作為一種麻醉劑，通過抑制仿刺參肌肉組織中神經肽的功能而影響肌肉的緊張或放松，但這種抑制是可逆的［15］。當薄荷醇作用于動物皮膚和表面黏膜時，在體積分數4%以下時表現出清涼及刺激和局麻的作用，當體積分數高于6%時，會有灼燒感［16］，這與本實驗研究的仿刺參麻醉作用效果是基本一致的。通過對仿刺參表觀麻醉行為特征的觀察可以得出，薄荷醇體積分數安全有效濃度范圍寬泛，在體積分數 0.25%～4%時仿刺參幼參都能夠較快地達到麻醉狀態，且在短時間內復蘇達到良好的自然狀況，正常攝食并保持較好的活力。

3.2體質量、溫度對薄荷醇麻醉效果的影響

麻醉劑的麻醉效果與麻醉生物的種類、生理狀態、體質量和水溫、溶氧等環境條件等因素密切相關，其中體質量和水溫是影響麻醉效果的關鍵因素。

在魚類研究中，一般來說，體質量對麻醉劑的安全濃度和有效濃度起著重要的作用，體質量越大，所需的麻醉劑濃度越高［17］。本實驗發現在相同水溫條件下，經相同時間進入麻醉狀態的大規格幼參所需麻醉劑濃度要高于小規格幼參，與魚類研究結果類似。其原因可能是通常情況下同一種水產生物的體質量越大，耗氧率越低［18］。因此，在相同條件下，幼參體質量越大，呼吸代謝強度越低，單位時間內攝入的麻醉液量少，達到麻醉和復蘇狀態所需的時間會相

應的更長。水溫是影響麻醉劑麻醉效果的重要環境因素之一［19］，在麻醉濃度相同時，隨著水溫的升高，麻醉效果逐漸增強，麻醉所需時間逐漸縮短。有研究表明，在一定的水溫范圍內，水溫越高，薄荷醇的麻醉效果越好［15］。本實驗水溫11～19呼吸頻率越快，單位時間內攝入或排出體內的麻醉藥液量越多，因此麻醉和復蘇時間均相應縮短。當水溫超過 19℃時個別幼參出現棘收縮的現象，尤其在水溫21℃時麻醉的仿刺參出現身體蜷縮、棘收縮、口周圍觸手完全不伸展、平均復蘇時間明顯延長等現象，用?低濃度薄荷醇麻醉幼參時麻醉狀態基本相同，這與魚類在高水溫下進入麻醉狀態所需的麻醉濃度較低不同［3］。分析認為，這可能與仿刺參自身的生理特性有關，因仿刺參具有體表、呼吸樹雙重呼吸特性［20］，溫度直接影響到呼吸代謝的強度，溫度越高影響較大。但當水溫在 21℃以上時，麻醉時幼參的呼吸代謝可

能受到較強抑制，因此，在麻醉過程中表現出的狀態與其他溫度段有較大差異，麻醉效果不甚理想，不適宜對仿刺參進行麻醉。

3.3麻醉對仿刺參體長的影響

在進行仿刺參體長測量時，體長的變異系數反映出測量值的離散程度，變異系數越大，說明測量結果越分散，越不穩定。本實驗研究可以看出，對照組體長變異系數較大，而麻醉組變異系數明顯減小，兩者差異顯著（P<0.05），說明薄荷醇的麻醉抑制了仿刺參身體的收縮和舒展，不僅使體長多次測量值趨于穩定，而且也更能準確地反映仿刺參的真實體長。仿刺參體長測量操作需時短，基于麻醉時間以及麻醉后復蘇時間過長或過短均不利于盡快完成相關操作的要求，故要選擇適宜的麻醉濃度完成測量操作，這對在短時間內復蘇并恢復到正常狀態，確保對仿刺參不產生過度的應激或造成傷害，顯得非常重要。針對本實驗中仿刺參的麻醉程度、麻醉時間和復蘇時間來綜合分析，可以看出，在薄荷醇體積分數為0.25%時，大中規格的仿刺參麻醉時間較長而復蘇較快，未能達到有效的麻醉程度，會導致體長測量結果有誤差。由此可以得出，在進行麻醉測量體長時，對體質量20 g以上的幼參適宜的麻醉的體積分數為0.5%～1%，對體質量 20 g以下的幼參適宜的麻醉的體積分數為 0.25%～0.5%，這樣可以顯著提高測量體長的準確性，而20 g以下的糙海參適宜的薄荷醇體積分數為2%［15］，這可能與海參種類及生活環境習性有關。當然，仿刺參在麻醉和復蘇的過程中存在較大的個體差異，同時水溫、鹽度、溶氧等環境因素也有交互性影響，因此在進行科學實驗及實際生產中，應視實際情況對麻醉劑量進行靈活調整。

綜上所述，說明薄荷醇對仿刺參幼參具有較好的麻醉效果，且無毒副作用，價格低廉，安全可靠。因此，薄荷醇可以作為仿刺參很好的麻醉劑應用于科學實驗和實際生產中，尤其是應用于對其體長的準確測量方面。另外，根據麻醉用途的不同，今后有待于深入探討以薄荷醇作為麻醉劑在生產中其他方面的應用研究開發，如通過對稚幼參麻醉剝離進行高效分苗或清除敵害生物等。

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.These results suggest that，within the temperature range from 11℃

to 21℃，the effective anesthetic concentration of menthol is approximately 0.5% to 1% for individuals with body weight greater than 20 g and approximately 0.25% to 0.5% for individuals less than 20 g in body weight.

（本文編輯： 梁德海）

Anesthetic effect of menthol on juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus

HAN Sha，HU Wei，LI Cheng-lin，ZHAO Bin，YAN Fang
（Marine Biology Institute of Shandong Province，Qingdao 266104，China）

Received: Aug.2，2015

Key words:Apostichopus japonicus； menthol； anesthetization； water temperature

Abstract:The aim of this study was to establish an anesthetic method for accurate body length measurement.We investigated the anesthetic effect of menthol on different-sized（large，42.37 g±1.99 g； medium，22.91 g±1.03 g；small，12.09 g±1.51 g）Apostichopus japonicus juvenile sea cucumbers in different concentrations and at different water temperatures（11，13，15，17，19，21℃）.The results showed that the anesthetic effect of menthol took effect quickly and the recovery rate reached 100% at concentrations less than 4%.The anesthetic time and recovery time were significantly different for large individuals at concentrations of 0.25%，0.5%，and 1%，but they were not significantly different for medium-sized and small ones.Within the temperature range from 11℃ to 19℃，the anesthetic time for sea cucumbers was shortened from 15.62 min±1.31 min to 12.17 min±0.21 min，while the recovery time increased from 13.61 min±4.85 min to 28.10 min±7.35 min.The anesthetic effect was significantly different at different temperatures（P<0.05）.It was unfit for anesthetization because the status of the sea cucumber was abnormal when the temperature was higher than 21℃

中圖分類號：S917.4

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3096（2016）03-0010-07

doi：10.11759/hykx20150826001

收稿日期：2015-08-02； 修回日期： 2015-10-17

基金項目：山東省農業良種工程項目（2014-2016）； 山東省科技發展計劃項目（2014GNC111022）； 國家海洋局海洋公益性行業科研專項經費項目（201305001-4）； 山東省現代農業產業技術體系刺參產業創新團隊建設項目（SDAIT-08-011-01）； 山東省農業科技成果轉化資金項目

作者簡介：韓莎（1985-），女，山東青島人，助理研究員，主要從事海洋生物生理生態學研究，E-mail： shahan_2012@163.com； 李成林，通信作者，研究員，電話： 0532-82657692，E-mail： lcl_xh@hotmail.com