反相離子色譜法同時檢測皮炎軟膏中的6種水溶性維生素成分含量

葉翠平 譚兆平 區(qū)碩俊

摘 要：建立了反相離子色譜法同時測定皮炎軟膏中6種水溶性維生素成分的分析方法。樣品經(jīng)提取凈化后，用反相色譜柱梯度洗脫分離，二極管陣列檢測器進行檢測。在給定的濃度范圍內(nèi)各水溶性維生素成分的濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）在0.999 1～0.999 9之間。添加水平在0.5～200 mg/kg時回收率為86.0%～96.0%，相對標準偏差RSD（n=6）為3.60～7.45 %。方法檢出限為0.30～0.50 mg/kg。該方法操作簡便，準確度高，重現(xiàn)性好，是測定皮炎軟膏中水溶性維生素成分的有效方法。

關(guān) 鍵 詞：反相離子色譜；皮炎軟膏；水溶性維生素；同時測定

中圖分類號：TQ 463 文獻標識碼： A 文章編號： 1671-0460（2016）08-2050-04

Abstract： A reversed-phase ion chromatography method was established for determination of six water-soluble vitamins in dermatitis ointment. Samples were extracted and purified， and then they were tested by the reverse-phase high performance liquid chromatography instrument with diode array detector. All the compounds showed good linearity within the corresponding concentrations， with the correlation coefficient from 0.999 1 to 0.999 9. The recoveries of the method were from 86.0 to 96.0% with the RSD（n=6）values from 3.60% to 7.45% at the spiked levels from 0.50 mg/kg to 200 mg/kg. The detection limits of the method were from 0.30 mg/kg to 0.50 mg/kg. This method is convenient， accurate， and has good reproducibility and is suitable for determination of these water-soluble vitamins in dermatitis ointment.

Key words： reversed-phase ion chromatography； dermatitis ointment； water-soluble vitamins； simultaneous determination

維生素是維持機體代謝和生長所必需的一類低分子化合物的統(tǒng)稱。在生物體內(nèi)，其主要功能是通過作為輔酶的成分，調(diào)節(jié)機體代謝[1-3]。在水溶性維生素當中，B族維生素對于機體中的代謝尤為重要，缺乏時，可導致機體中氨基酸、糖原、脂肪和激素等代謝平衡遭到破壞，從而食欲不振、體重減輕、失眠、疲勞、記憶力和工作能力減退等癥狀，嚴重時甚至還會發(fā)生各種皮炎[4-8]。

對于治療各種皮炎癥狀，B族維生素的直接接觸對于治療具有快速方便的特點。但近年來，醫(yī)藥產(chǎn)品問題層出不窮，為保障消費者的利益和人身安全，必須加大假冒偽劣產(chǎn)品的檢測力度。目前，我國對水溶性維生素的檢測標準步驟繁瑣，維生素在提取過程中易分解，而微生物法和毛細管電泳法耗時耗力且重現(xiàn)性較差[9-11]。本實驗建立了同時檢測皮炎軟膏中的6種水溶性維生素成分的高效液相色譜法，在優(yōu)化條件下得到了良好的分離，并提高了結(jié)果的準確性，為檢測藥用產(chǎn)品中水溶性維生素的含量提供了參考方法。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑與儀器

皮炎軟膏（廣州市售）；鹽酸、碘化鉀、甲醇、丙酮、甲酸（分析純，廣州試劑廠）；戊烷磺酸鈉（色譜純，上海伊卡生物技術(shù)有限公司）；乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；水為超純水；維生素B2（核黃素）、維生素B3（煙酸、煙酰胺）和維生素B6（鹽酸吡哆醛、吡哆醇、鹽酸吡哆胺）標準品（含量≥99%，國家標準物質(zhì)中心）。

日本島津LC-20A高效液相色譜儀，配有SPD-M20A二極管陣列檢測器和LC-20AT四元泵。MS3 basic漩渦混合器（德國IKA公司）；D3024R冷凍高速臺式離心機（美國賽洛捷克Scilogex公司）；CSR-1-200超純化水機（北京愛思泰克科技開發(fā)有限責任公司）；

1.2 標準溶液及溶液的配制

煙酸、煙酰胺、吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺標準貯備液：分別準確稱取標準品，用2 %甲醇水溶液溶解并稀釋至刻度，配制成100 mg/L的貯備液。

核黃素標準貯備液：準確稱取標準品，用pH為3的鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，配制成100 mg/L的貯備液。

混合標準工作液：將上述6種水溶性維生素的標準貯備液按比例用水稀釋，各濃度分別為0、0.5、2、5、10、20、50 mg/L。

流動相緩沖液：準確稱取1.0 g戊烷磺酸鈉，用pH為2.5的甲酸水溶液定容至1 L。經(jīng)0.45 μm濾膜過濾待用。

1.3 樣品的前處理

稱取1.0 g樣品于50 mL棕色具塞比色管中，加入約0.5 g碘化鉀，再加入25 mL pH為3的鹽酸溶液并振搖3 min后，然后加入5 mL丙酮振搖均勻后，用水定容至刻度處加蓋搖勻。吸取約2 mL定容后溶液于離心管中，冷凍離心20 min（15 000 r/min，2 ℃），上清液用0.22 μm濾膜過濾，待測。

1.4 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Kinetex C18 （250 mm×4.6 mm×5 μm）；柱溫：30 ℃；進樣量：20 ?L；流量：1.0 mL/min；檢測波長：200～390 nm；流動相：A乙腈、B緩沖液（表1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品處理條件的選擇

2.1.1 不同pH鹽酸溶液對回收率的影響

由于核黃素與其它5種水溶性維生素性質(zhì)差異較大，在常溫下微溶于水，為了確保回收率，不能直接用純水進行提取。而核黃素在酸性溶液下能體現(xiàn)出較強的穩(wěn)定性，因此，選取了甲酸、鹽酸和磷酸進行了對比實驗。結(jié)果顯示，核黃素在強酸性溶液中有較高的回收率，而且相比起甲酸和磷酸，鹽酸具有更低的紫外吸收，對色譜圖的影響最少。考慮到色譜柱的耐受程度，選取了pH為3的鹽酸溶液作為提取液（圖1）。

2.1.2 碘化鉀對回收率的影響

由于水溶性維生素容易受光照、氧化等不同因素的破壞分解，所以在提取中加入適量的抗氧化劑有助于提高回收率。而由于采用了二極管陣列檢測器，所以選擇沒有紫外吸收的鹽作為抗氧化劑。二氧化硫及其衍生物由于對紫外光有吸收，所以不能選用焦亞硫酸鈉和亞硫酸氫鈉等作為抗氧化劑，以免影響分析。而亞硫酸鈉雖然并沒有紫外吸收，但由于濃度較大且體系中加入了鹽酸，所以S=O雙鍵會在276 nm處出現(xiàn)吸收[12]。綜合考慮，最終選用了沒有紫外吸收且還原性較好的碘化鉀作為水溶性維生素的抗氧化劑。結(jié)果表明，碘化鉀的加入對水溶性維生素的回收率有一定的提高（圖2）。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 緩沖液的選擇

由于維生素B6電離能力較強，在反相色譜柱中保留能力低，因此需要在流動相中加入離子對試劑。從而增加樣品離子在非極性固定相中的溶解度，使分離度增大，改善峰型。同時，因為維生素B6呈弱堿性，所以在色譜柱的承受范圍內(nèi)，用甲酸調(diào)節(jié)pH至2.5，使其能充分電離，從而有效地改善了峰型，提高了方法的靈敏度。

2.2.2 有機相的選擇

本實驗對比了甲醇和乙腈作為有機相對色譜圖效果的影響。使用甲醇作為有機相時，雖然增加了化合物在色譜柱中的保留時間，但甲醇與水相混溶時，在梯度洗脫的條件下，產(chǎn)生的溶解熱導致基線波動較大，影響分析。而乙腈雖然洗脫能力較甲醇大，但基線穩(wěn)定，且能保持組分間有較好的分離度，故選用了乙腈作為有機相（圖3）。

2.3 線性關(guān)系和檢出限

將不同濃度的標準工作溶液在注入液相色譜進行測定，以濃度X（mg/L）為橫坐標，相應的峰面積Y為縱坐標，進行線性回歸，相關(guān)系數(shù)r在0.9991～ 0.999 9之間，結(jié)果表明6種水溶性維生素的濃度和相應的峰面積呈良好的線性關(guān)系。以儀器的RS/N=3計算，分別測得6種水溶性維生素最低儀器檢出限，再根據(jù)稀釋倍數(shù)確定方法檢出限，詳細結(jié)果見表2。

2.4 回收率及精密度實驗

用市售的皮炎軟膏進行方法學實驗，先測定其本底值，然后按照加標原則進行三個水平的添加，維生素B6的含量按照 GB 5413.13-2010將吡哆醛、吡哆胺折算為吡哆醇計算，最終測得平均回收率為86.0%～96.0%。對各加標水平進行平行測定6次，日內(nèi)相對標準偏差（RSD）在3.60%～7.45%范圍內(nèi)，說明該方法重現(xiàn)性好，精密度高，達到分析要求（表3）。

3 結(jié) 論

本實驗基于水溶性B族維生素的性質(zhì)，采用了酸溶液提取法同時提取，并加入了碘化鉀進行抗氧化，在不影響色譜圖效果的前提下有效地提高了6種維生素組分的回收率。優(yōu)化的色譜方法增加了維生素B6在色譜柱中的保留能力，有效地改善了峰型。6種維生素組分在30 min內(nèi)有良好的分離度，且該方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，操作簡便，適用于軟膏類產(chǎn)品中維生素B2、B3和B6的日常檢驗。

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