人核糖核酸酶抑制因子siRNA慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定

丁 寧，邱景劍，王定友，李劭恒，張 云，李 坤

（大連大學 醫(yī)學院，遼寧 大連 116622）

人核糖核酸酶抑制因子siRNA慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定

丁 寧，邱景劍，王定友，李劭恒，張 云，李 坤

（大連大學 醫(yī)學院，遼寧 大連 116622）

本實驗旨在構(gòu)建人核糖核酸酶抑制因子穩(wěn)定干涉載體pLKO.1-dsRI，為后續(xù)觀測人核糖核酸酶抑制因子干涉載體的表達對腫瘤細胞的影響奠定基礎(chǔ)。用亞克隆法,將針對人核糖核酸酶抑制因子的干涉片段從 Simple T-dsRI質(zhì)粒克隆到pLK-0.1-TRC質(zhì)粒,用酶切法篩選得到陽性重組質(zhì)粒pLKO.1-dsRI，用測序法鑒定克隆序列正確。轉(zhuǎn)染時設(shè)干擾組、空載體組和空白組三組，每組三次重復。用脂質(zhì)體CellfectinR將pLKO.1-dsRI（干擾組）、pLKO.1-TRC（空載體組）轉(zhuǎn)染進人肝癌細胞HepG2細胞中，未處理的細胞作空白組。轉(zhuǎn)染后72hr用Western blotting檢測細胞中核糖核酸酶抑制因子表達的變化。雙酶切鑒定及測序鑒定結(jié)果均正確；Western blotting結(jié)果表明，對比空白組（1.1578±0.015）和空載體組（1.1216±0.027），干擾組RI表達（0.6119±0.048）明顯下調(diào)（P<0.05）。結(jié)果表明人核糖核酸酶抑制因子干涉載體pLKO.1-dsRNH1構(gòu)建成功。

人核糖核酸酶抑制因子；siRNA；慢病毒載體

人核糖核酸酶抑制因子（human ribonuclease inhibitor，hRI）是一種廣泛存在于細胞的可溶性酸性糖蛋白，分子量為50kD，能緊密結(jié)合血管形成因子（Angionenin,Ang）[1,2]。已有實驗證實，RI可能有效地抑制腫瘤誘導血管生成[3,4]。因此人們推測hRI可能為抗腫瘤血管活性的抑制基因，有望應用于腫瘤的基因治療中。以往的工作將靶向RI基因構(gòu)建于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，但是該載體在分裂不活躍的細胞中如神經(jīng)元細胞中的轉(zhuǎn)染效率較低，因而本研究構(gòu)建了RNA干擾人RI基因的慢病毒載體，旨在利用RNAi技術(shù)沉默分裂不活躍的細胞中的RI基因，為下一步深入研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

慢轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pLKO.1-TRC（圖1）、E.coli DH5α由大連大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室保存；針對人核糖核酸酶抑制因子siRNA表達載體Simple T-dsRI由大連Takara生物公司構(gòu)建[3]。限制性內(nèi)切酶EcoR1、DNA Marker、T4DNA連接酶購自TaKaRa；限制性內(nèi)切酶Age1購自NEB；DNA快速凝膠產(chǎn)物回收試劑盒購自博大泰克公司；瓊脂糖、氨芐青霉素和鏈霉素購自華美生物公司；LB培養(yǎng)基購自Invitrogen/GIBCO。

圖1 pLKO.1質(zhì)粒圖譜

1.2 方法

1.2.1 重組載體pLK0.1-dsRI的的構(gòu)建、鑒定及測序

質(zhì)粒 pLK0.1-TRC經(jīng) Agel單酶切、Klenow Fragment和dNTP補平后，用乙醇沉淀法回收得到約7.1 kb的pLKO.1-TRC的線性大片段，再用EcoRⅠ酶切，經(jīng)瓊脂糖電泳回收，得到約7 kb的一端平頭、一端黏性的線性載體大片段。針對人核糖核酸酶抑制因子的siRNA表達載體Simple T-dsRI質(zhì)粒用SmaⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，經(jīng)2%瓊脂糖電泳回收，獲得約84bp目的片斷（dsRI）。將線性載體片段與目的片段用T4DNA連接酶連接、轉(zhuǎn)化，涂布于氨芐青霉素抗性平板，挑取單菌落，提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和NcoⅠ進行雙酶切pLK0.1-dsRI，篩選得到正向連接的陽性克隆。

1.2.2 HepG2細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

細胞在含100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素和10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。按4×104個/孔將細胞鋪板于24孔板，至60%～70%匯片時，按CellfectinR說明書轉(zhuǎn)染，分為3組：正常細胞組（空白組）、pLKO.1-dsRI（干擾組）、pLKO.1-TRC（空載體組），2個平行復孔。每組質(zhì)粒共用0.8μg、脂質(zhì)體2μL。轉(zhuǎn)染后24 h，換成完全培養(yǎng)基培養(yǎng)72 hrs后收獲。

1.2.3 Western blotting檢測核糖核酸酶抑制因子的表達

各組取60 μg總蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉4℃封閉過夜、RI一抗（1:1000稀釋）過夜，然后再用HRP標記的二抗IgG（1:2000稀釋）室溫反應1～2 h。用ECL發(fā)光試劑盒反應液發(fā)光。曝光時間30 s～5 min。由Bio-Rad凝膠成像儀攝取凝膠圖像，用Image LAbTM軟件進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 重組載體pLK0.1-dsRI的構(gòu)建

質(zhì)粒dsRI-T Simple為本實驗室以往構(gòu)建的克隆載體，長約3042 bp，經(jīng)SmaⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，得到約 2.7 Kb和 84 bp兩條帶（圖 2）。質(zhì)粒pLK0.1-TRC經(jīng)Agel單酶切和Klenow Fragment和dNTP補平后，獲得約8.9 kb的線性載體大片段（圖2）；再用EcoRⅠ單酶切后，得到7 Kb和2 Kb兩條帶（圖3），然后切膠回收7 Kb條帶（圖4）。

圖2 質(zhì)粒pKD-dsRI-T Simple的雙酶切和質(zhì)粒pLKO.1-TRC用AgeⅠ單酶切/Klenow補平電泳圖

圖3 EocRⅠ酶切經(jīng)Klenow補平的pLKO.1-TRCF片段凝膠電泳圖

圖4 回收約7 kb的片段凝膠電泳圖

2.2 質(zhì)粒酶切鑒定

質(zhì)粒pLK0.1-dsRI分別用EcoRⅠ和NcoⅠ酶切后，瓊脂糖凝膠電泳檢測到大小約為5000 bp和1900 bp兩條片段，與預期結(jié)果符合，表明酶切正確（見圖5）。

圖5 質(zhì)粒pLKO.1-dsRI雙酶切凝膠電泳圖

2.3 Western blotting檢測核糖核酸酶抑制因子的表達

Western blotting顯示，與空白組和空載體組對比，干擾組中hri基因被顯著下調(diào)（P<0.05），抑制率大于60%：空白組的相對表達強度為1.1578±0.015，空載體的相對表達強度為1.1216±0.027，干擾組的相對表達強度為0.6119±0.048。可見，hri基因在蛋白水平上被沉默（見圖6）。

圖6 Western blotting檢測HepG2細胞中hRI的表達

3 討論

人核糖核酸酶抑制因子是體內(nèi)重要的蛋白質(zhì)。其一級結(jié)構(gòu)富含亮氨酸和大量的游離巰基[9]，空間結(jié)構(gòu)由富含亮氨酸殘基重復區(qū)（Leucin-rich reapeat，LRR）的α/β螺旋折疊結(jié)構(gòu)重復多次形成的彎曲的馬蹄形結(jié)構(gòu)。而含有這樣重復順序的一百多種蛋白質(zhì)顯示了廣泛的功能，包括細胞周期調(diào)節(jié)、DNA修復、細胞外基質(zhì)的相互作用等。且游離巰基是RI保持活性的必要因素[10-13]。因此，RI功能是多方面的。

本研究旨在成功構(gòu)建人核糖核酸酶抑制因子干涉載體pLKO.1-dsRI。本研究所選載體為一種慢病毒表達載體，其優(yōu)點是能夠感染多種難感染的細胞，比如原代細胞，干細胞，神經(jīng)元細胞等，有利于后續(xù)實驗檢測。而且慢病毒能夠?qū)⑼庠椿虿迦爰毎蚪M內(nèi)，既可轉(zhuǎn)染分裂期活躍的細胞，也可轉(zhuǎn)染分裂緩慢或處于分裂終末期的細胞[14,15]，實現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。對構(gòu)建的質(zhì)粒進行PCR檢測，結(jié)果顯示產(chǎn)物都位于約192 bp之間，與預期結(jié)果相符；再用EcoRⅠ和NcoⅠ對質(zhì)粒進行雙酶切，電泳條帶顯示：一條在2 kb，另一條在5 kb，與理論值相符；同時將質(zhì)粒送寶生物測序，各項結(jié)果共同顯示慢病毒pLKO.1-dsRI載體構(gòu)建成功。

本研究成功構(gòu)建了人核糖核酸酶抑制因子干涉載體pLKO.1-dsRI，其能在腫瘤細胞中穩(wěn)定地表達，這為后續(xù)觀測人核糖核酸酶抑制因子干涉載體的表達對腫瘤細胞的影響奠定了基礎(chǔ)。

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Construction and Identification of Human Ribonuclease Inhibitor siRNA Lentiviral Vector

DING Ning,QIU Jing-jian,WANG Ding-you,LI Shao-heng,ZHANG Yun,LI Kun
(College of Medicine,Dalian University,Dalian 116622,China)

To construct the interference expression vector of human ribonuclease inhibitor pLKO.1-dsRI which express in tumor cells can lay the foundation for the subsequent observations.The purpose fragments of dsRI from the plasmid of Simple T-dsRI was subcloned into the lentiviral vector of pLKO.1-TRC.The vector was identified by enzyme digested.And then the shRNA-RI lentiviral vector of pLKO.1-dsRNH1 transfected into HepG2 cells with CellfectinR,using the cells transfected with empty vector of pLKO.1-TRC as blank groups and those untransfected cells as controls.After72hrs,the silencing effect of the siRNA plasmid was identified by Western blotting on the HepG2 cells.Restriction enzyme digestion proved that the construction of the retroviral vector expressing shRNA targeting hRI gene was correct.Western blotting showed that the expression of hRI were significantly reduced in the cells transfected with shRNA-hRI retroviral vector as compared with the blank and the empty vector group,and the ratio value of hri/β-actin is 0.6119±0.048 vs 1.1578±0.015,1.1216±0.027（P<0.05）.The human ribonuclease inhibitor interference vector pLKO.1-dsRI was constructed successfully.

Human ribonuclease inhibitor;siRNA;lentiviral vector

Q782

：A

：1008-2395(2016)06-0062-04

2016-10-31

大連大學本科生創(chuàng)新課題（2015125）；大連大學本科生創(chuàng)新課題。

丁寧(1977-)，女，實驗師，研究方向：腫瘤分子生物學。