基于Walker 256惡性胸水模型的中藥甘遂量毒效關系研究

沈娟 唐于平 徐遠超 開鈞 宿樹蘭 錢大瑋 張麗 段金廒

[摘要]該文考察中藥甘遂的量毒效關系，探討甘遂的毒效變化特點，為臨床安全合理用藥提供科學依據。以惡性胸水模型為研究對象，在較大劑量范圍內（甘遂0045～1620 g·kg-1·d-1）考察甘遂對實驗動物生化指標、胸水量等的影響，并通過因子分析方法綜合評價甘遂的量毒效關系。結果顯示，模型組大鼠具有較多的胸水量，且與空白組比較，ALT，AST，LDH，HBDH，IFNγ，IL2，TNFα顯著升高（P<005），TP，ALB降低（P<005）。給藥后，與模型組比較，各組可不同程度的減少胸水量，降低IFNγ，IL2，TNFα，升高TP，ALB，體現出一定的治療作用，同時引起ALT，AST，LDH，HBDH升高，體現出一定的肝、心臟毒性。通過因子分析從9個指標中抽提出2個公因子，共解釋了891%的信息。結果表明，甘遂在《中國藥典》劑量范圍內單獨給藥沒有見到明顯毒性，在藥典高限3倍劑量下可產生肝臟、心臟毒性，隨著劑量增加，毒性增強；同時甘遂具有“峻下逐水”功效，可減少惡性胸水模型大鼠的胸水量及改善相關生理指標，且具有劑量依賴性。綜合分析其毒效特點，甘遂藥典高限劑量為其相對最佳治療劑量。

[關鍵詞]甘遂；量毒效關系；因子分析；惡性胸水

[Abstract]To investigate the dosagetoxicityefficacy relationship of Kansui Radix， explore its regularity of the toxicity and efficacy change， and provide scientific basis for its clinical rational application， the malignant pleural effusion models were used to observe the effect of Kansui Radix with larger dose range （00451620 g·kg·d-1 for Kansui Radix） on biochemical indexes and hydrothorax volume in experimental animals Factor analysis method was also used to comprehensively assess the dosagetoxicityefficacy relationship of Kansui Radix The results showed that the rats in model group had larger hydrothorax volume， and ALT， AST， LDH， HBDH， IFNγ， IL2 and TNFα levels were significantly increased （P<005）， while TP and ALB levels were decreased （P<005） as compared with the blank group After drug administration， various treatment groups decreased hydrothorax volume， IFNγ， IL2， TNFα and increased TP and ALB levels as compared with model group， indicating certain therapeutic effect； and increased ALT， AST， LDH and HBDH levels， indicating certain liver and cardiac toxicity In the factor analysis， two common factors were extracted from nine indexes， explaining 891% of the information The analysis results suggested that there was no obvious toxicity in case of independent use of Kansui Radix within the dosage range set in pharmacopeia， while it would produce liver toxicity and cardiac toxicity upon 3 times of the dosage set in pharmacopeia， and the toxicity was increased with the increase of dose At the same time， Kansui Radix can decrease the hydrothorax volume in malignant pleural effusion models and improve relevant physical indexes in a dosedependent manner Comprehensive analysis results of its toxic effect characteristics indicated that the upperlimit dose of Kansui Radix in pharmacopeia shall be regarded as the relatively optimal therapeutic dose

[Key words]Kansui Radix； dosagetoxicityefficacy relationship； factor analysis； malignant pleural effusion

doi：10.4268/cjcmm20160923

中醫(yī)藥是中華民族的瑰寶，經過幾千年的臨床實踐檢驗，為中華民族的繁榮昌盛做出了巨大貢獻[12]。療效是中醫(yī)藥得以存續(xù)以及發(fā)展的根本，提高其療效則是目前振興中醫(yī)藥事業(yè)的首要之策。中醫(yī)自古認為“中醫(yī)不傳之秘在于量”，這說明劑量是保證中藥臨床安全有效的重要因素，也說明了中藥量毒效關系的復雜性[34]。

甘遂為大戟科植物甘遂Euphorbia kansui TN Liou ex TP Wang的干燥塊根，是我國傳統(tǒng)中藥，歷代本草皆有收載，具有泄水逐飲、消腫散結的功效[5]。甘遂功效顯著、作用迅猛，被稱為“泄水圣藥”；同時又具有毒效并存的特點，在《神農本草經》中列為下品。李慧玉等[6]研究發(fā)現甘遂對水負荷小鼠具有較好的利尿作用，但對腎臟產生一定的毒性。甘遂經醋炙后，可降低其腎臟毒性，同時利尿作用增強[7]。姜瑋等[8]研究表明，甘遂對斑馬魚具有明顯毒性作用，并具有一定的量毒關系。筆者在前期研究中[9]亦發(fā)現甘遂對小鼠具有一定的肝、腎毒性。甘遂雖藥效顯著，但因其存在毒性，故在臨床上的應用受到很大限制。基于此，科學闡釋甘遂的量毒效關系，對于其臨床的安全合理應用顯得尤為重要。

中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論對藥物的藥效和毒性具有獨到的認識，“是藥三分毒”，對于藥物的藥效與毒性應辯證對待。《黃帝內經》中“有故無殞”之說，及現代認為的“有病則病當之，無病則體受之”思想，皆是強調了中藥的毒性與療效并存，并且隨著機體疾病狀態(tài)的不同而發(fā)生改變[1011]。因此，本文建立Walker 256惡性胸水模型，在較大劑量范圍（甘遂0065～2340 g·kg-1·d-1）考察甘遂“峻下逐水”效應及對實驗動物生化指標等的影響，并通過因子分析方法綜合分析甘遂的量毒效關系，為甘遂的安全合理應用提供參考。

1材料

11藥物甘遂產自陜西寶雞紅河谷地區(qū)（批號111206），由南京中醫(yī)藥大學王春根教授鑒定，為大戟科植物甘遂E kansui的干燥塊根。甘遂打粉過100目篩，用前加超純水配成所需藥液濃度。呋塞米購自上海朝暉藥業(yè)有限公司，批號1206F04。

12動物Wistar大鼠，72只，雄性，SPF級，體重220～250 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK（京）20120001。自由進食及飲水，實驗室溫度（22±2）℃，濕度60%～80%，人工光照約12 h明暗周期，并定期消毒。

13瘤株與試劑Walker 256細胞株購自上海斯信生物科技有限公司；丙氨酸氨基轉移酶（ALT），天冬氨酸氨基轉移酶（AST），總蛋白（TP），白蛋白（ALB），肌酐（CREA），堿性磷酸酶（ALP），尿氮素（BUN），總膽紅素（TBIL），血糖（GLU），甘油三酯（TG），肌酸磷酸激酶（CK），總膽固醇（TCHO）測定試劑盒，AU生化專用清洗液，生化多項校準品，生化多項質控品1，生化多項質控品2均購自美國貝克曼公司；大鼠γ干擾素（IFNγ）酶聯免疫分析試劑盒，大鼠白細胞介素2（IL2）酶聯免疫分析試劑盒，大鼠腫瘤壞死因子α（TNFα）酶聯免疫分析試劑盒均購自南京建成生物工程有限公司。

14儀器AU680全自動生化分析儀（美國貝克曼公司）；EPED超純水系統(tǒng)（南京易普達易科技發(fā)展有限公司）；酶標儀（美國Molecular Devices公司）。

2方法

21造模方法Walker 256細胞株每周傳代1次，7 d后抽取小量腹水，置于消毒的干試管內，鏡下進行細胞分類計數。以生理鹽水調整細胞濃度，用細胞計數板計數腫瘤細胞濃度至5×107個/mL。用臺酚藍拒染法檢測細胞存活性，提示活細胞數>95%時，再抽取腹水放入無菌容器內，置冰塊上保存，以上法稀釋調整細胞濃度至1×107個/mL。大鼠麻醉后，將大鼠右側背部用刮刀脫毛，局部常規(guī)消毒，用穿刺針自大鼠右側腋后線與11，12肋間交點處垂直刺入，當針頭刺入胸膜腔時感覺有落空感后向胸腔內注入03 mL上述腫瘤細胞懸液。正常對照組注射等量生理鹽水。

22分組與給藥大鼠隨機分為空白對照組、模型組、陽性藥組（呋塞米4 mg·kg-1）、不同劑量甘遂給藥組，共9組，每組8只。根據甘遂藥典用量（甘遂05 ～ 15 g，換算成大鼠等效量為甘遂0045～0135 g·kg-1），共設置6個給藥劑量，分別為0045 g·kg-1（藥典低限劑量，以下簡稱低限劑量）、0135 g·kg-1（藥典高限劑量，以下簡稱高限劑量）、0405 g·kg-1（藥典高限3倍劑量，以下簡稱3倍劑量）、081 g·kg-1（藥典高限6倍劑量，以下簡稱6倍劑量）、1215 g·kg-1（藥典高限9倍劑量，以下簡稱9倍劑量）和1620 g·kg-1（藥典高限12倍劑量，以下簡稱12倍劑量）組。以上各組自造模后第2天灌胃給藥1次/d，給藥劑量按體重計001 mL·g-1，給藥7 d。

23生化指標測定在給藥第7天末，每組大鼠眼眶靜脈叢取血，離心后取血清，按說明書要求測定ALT，AST，TP，ALB，CREA，ALP，BUN，TBIL，GLU，TG，CK，TCHO，IFNγ，IL2，TNFα水平。

24胸水量測定在給藥第7天末，每組大鼠頸動脈放血處死動物，稱重，小心剖開胸腔，用注射器抽取胸水并用吸水紙吸干胸水后再次稱重，2次稱重差即為胸水量。

25統(tǒng)計學方法所有實驗數據以±s表示，各組之間比較采用單因素方差分析以及因子分析，均采用SPSS 170統(tǒng)計軟件處理，顯著性概率水平α=005。

3結果

31一般情況觀察正常組大鼠精神狀態(tài)良好，行動靈活，毛發(fā)光澤，二便正常。模型組及給藥組大鼠精神萎靡，被毛臟亂、紅染，嘴唇青紫，肛周污穢。各組大鼠每2 d稱重1次，結果見表1。模型組及給藥組大鼠體重在造模后前3 d體重有增長趨勢，且比空白組增長快，可能因胸水生成，導致體重增加。造模后期，體重開始減少，主要由于后期大鼠進食減少而造成。與空白組比較，給藥7 d，模型組、陽性組及低限劑量組體重顯著降低（P<005），隨著甘遂給藥劑量的增加，體重有恢復趨勢，與空白組逐漸接近，并具有一定的劑量依賴性。

沈娟等：基于Walker 256惡性胸水模型的中藥甘遂量毒效關系研究表1不同劑量甘遂對體重的影響（±s，n=8）

。

32對大鼠胸水量的影響不同實驗組大鼠的胸水量見表2。與模型組比較，各給藥組均可不同程度的減少胸水量（P<005），且具有一定的劑量依賴性。其中，藥典高限劑量可明顯降低大鼠胸水量，隨著劑量增加，胸水量減少。各組胸水量由多到少依次為：模型組>低限劑量組>陽性組>高限劑量組>3倍劑量組>6倍劑量組>9倍劑量組>12倍劑量組。

33對大鼠血清生化指標的影響不同實驗組大鼠的生化指標結果見表2。與空白組比較，模型組ALT，AST，LDH，HBDH，IFNγ，IL2，TNFα顯著升高（P<005），TP，ALB降低（P<005）。給藥后，與模型組比較，各組可不同程度的引起ALT，AST，LDH，HBDH升高，體現出一定的肝、心臟毒性，引起IFNγ，IL2，TNFα降低，TP，ALB升高，體現出一定的治療作用。其中，甘遂劑量大于或等于藥典高限劑量時，與模型組比較，可顯著升高IFNγ，TNFα值（P<005）；甘遂劑量大于或等于藥典高限表2不同劑量甘遂對胸水量及生化指標影響

34基于因子分析的甘遂量毒效關系研究采用因子分析法提取給藥后變化明顯的9個指標的公因子，見表3。首先進行預計算及適用性檢驗，KMO統(tǒng)計量=0745>07，可以接受，Bartlett′s Test χ2=135896，單側P=0000<001，表明適宜做因子分析。根據因子分析原則，以特征值大于1為顯著性標準，有2個公因子特征值>1，提取這2個公因子，對總方差的累積貢獻率為891%，即構成的模型可解釋原始數據的891%的信息，故采用這2個公因子代替原始變量對甘遂量毒效關系進行分析。根據預計算結果，在因子分析中，自定義提取2個公因子，采用方差最大正交旋轉，得到各因子得分系數及載荷系數，見表3。變量載荷絕對值越大對公因子的影響越大，從表3可以看出，公因子1（F1）主要由TP，ALB，IFNγ，IL2，TNFα主導，這些指標主要反映甘遂“峻下逐水”功效及對惡性胸水的治療效應；公因子2（F2）主要由ALT，AST，LDH，HBDH主導，這些指標主要反映肝臟、心臟毒性。因此F1可以解釋為效應公因子；F2可以解釋為毒性公因子。其中，F1的貢獻率為47750%，F2的貢獻率為41352%，兩者貢獻率接近，即甘遂在治療惡性胸水時既具有一定的治療作用也存在毒性，臨床用藥需謹慎權衡毒效作用。根據因子載荷圖可以很直觀地看出甘遂的量毒效關系的演變趨勢，見圖1，圖中標記點為各組數據的均值。模型組在橫軸方向和縱軸方向都遠離正常組。給予不同劑量甘遂后，隨著給藥劑量增加，在縱軸方向與模型組偏離越來越遠，并向著空白組靠近，表明甘遂具有一定的治療作用；同時，在橫軸方向，隨著給藥劑量增加，各組向著遠離空白組和模型組方向偏離越遠，表明毒性也增加；兩者均具有一定的劑量依賴性。綜合考慮甘遂的毒性和治療效應，選擇藥典高限劑量給藥最佳，此時不僅具有較好的治療作用，且沒有表現出明顯的毒性作用。

4討論

甘遂作為我國傳統(tǒng)的有毒中藥，具有峻下逐水作用，逐水能力很強，被后世醫(yī)家譽為“泄水之圣藥”；又具有毒效并存，難以控制的特點?！侗静菅芰x》謂其：“此藥專于行水功決為用，入藥需斟酌”[12]。甘遂因其在用藥劑量上難以把握，限制了其在臨床上的廣泛應用。因此，充分理解并闡釋甘遂的毒效變化特點對于指導臨床合理用藥意義重大。本文建立了Walker 256惡性胸水模型，在較大劑量范圍考察了甘遂劑量與毒性和效應的關系，從給藥后對大鼠血清生化指標、大鼠胸水量等的影響并結合因子分析方法研究了不同劑量甘遂的毒效變化特點。由實驗結果可以看出，甘遂在藥典規(guī)定的劑量范圍內單用沒有明顯毒性；超過藥典規(guī)定劑量，甘遂單用對肝、心臟有不同程度的損害，可引起相關生化指標異常；同時，甘遂對惡性胸水具有一定的治療作用，可明顯減少胸水量，改善相關血清生化指標，同時引起TP，ALB值升高，表明其“峻下逐水”作用引起血液濃縮。由因子分析中，各組與空白組、模型組偏離程度，可發(fā)現隨著甘遂劑量的增加，其“峻下逐水”效應增強，同時肝臟、心臟毒性也增加。綜合考慮毒性與效應，甘遂藥典高限劑量為最佳治療劑量，既具有較好的治療作用，又沒有明顯的毒性。

隨著社會的發(fā)展，科技的進步，中藥正在逐步走向國際化。然而，近年來中醫(yī)藥屢遭質疑與詬病，關鍵是中醫(yī)藥的療效與安全性問題。而把握恰當的用藥劑量，不僅能保證臨床用藥安全有效，而且也體現出了中醫(yī)治病的精髓?，F行《中國藥典》中記載的中藥用量主要是基于傳統(tǒng)用藥經驗，缺乏現代科學的闡釋與支撐。因此，明確中藥用藥劑量，研究其量毒效關系，對于保證中藥尤其是有毒中藥臨床用藥的安全有效具有重要意義。

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[責任編輯馬超一]