豬傳染性胃腸炎病毒分子生物學檢測方法研究進展

朱密

摘 要：該文介紹了豬傳染性胃腸炎病毒基因組織結構和基因表達方式，并分析了各功能蛋白的主要功能，最后分別介紹了核酸探針、普通RT-PCR方法、多重RT-PCR方法、套式PCR、熒光定量RT-PCR方法、環介導等溫擴增技術等分子生物學檢測方法在豬傳染性胃腸炎病毒檢測中的應用。

關鍵詞：豬傳染性胃腸炎；病毒分子；生物學檢測方法

中圖分類號 S858.28 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）12- 0110-02

豬傳染性胃腸炎（TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）導致豬出現脫水、水樣腹瀉以及嘔吐等為主要臨床癥狀的高度傳染性疾病，該病在春季、初秋以及冬季具有較高的發病率[1]。豬傳染性胃腸炎最早發生于美國，隨后在世界各地均有發生，我國于20世紀50年代首次發現該病，目前全國大部分地區均發生過豬傳染性胃腸炎。不同日齡和品種的豬均可以感染傳染性胃腸炎，其中以15日齡左右的仔豬發病后死亡率最高，高達100%；5周齡以上的仔豬感染傳染性胃腸炎后死亡率較低，但是會影響仔豬后期的生長，降低仔豬的飼料利用率。目前，該病已被世界動物衛生組織列為B類必檢傳染性疾病。近年來，隨著分子生物學技術的不斷發展，該技術已經廣泛用于各種細菌性和病毒性疾病的檢測[2]。本文綜述了分子生物學技術在傳染性胃腸炎中的應用，以期能為從事傳染性胃腸炎診斷和防控的工作者提供幫助。

1 傳染性胃腸炎病毒基因組結構和基因表達方式

1.1 TGEV基因組結構 傳染性胃腸炎病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，該病毒的基因組不分節段、單股正股RNA，具有高度傳染性。傳染性胃腸炎基因組全序列分為7個區29kb，結構序列為5'-la-lb-S-3a-3b-sM-M-N-7-3'，并且該基因組的3'-末端以共價鍵結合的poly結構，5'末端有帽結構[3]。基因組1約有20kb，主要負責病毒的編碼，其余基因均在近3'端。傳染性胃腸炎病毒全基因組編碼由4種結構蛋白和3種非結構蛋白組成，其中基因7、基因3和基因1為非結構蛋白，N、M、sM、S為傳染性胃腸炎的結構蛋白。

1.2 基因表達方式 傳染性胃腸炎病毒在胞漿脫殼以后，其正鏈RNA就呈現了mRNA的功能，使基因1轉錄表達RNA聚合酶，同時該基因有作為模板合成負鏈RNA，進而親代RNA與負鏈RNA形成雙鏈復制中間體。因此，在感染傳染性胃腸炎病毒的細胞內，可以檢測出不完全RNA、基因組RNA、mRNA以及雙鏈中間體4個特異性RNA，這可以作為豬傳染性胃腸炎病毒分子生物學檢測指標之一[4]。

2 結構蛋白及功能

豬傳染性胃腸炎病毒的結構蛋白主要為S糖蛋白、M蛋白、N蛋白以及sM蛋白等。S蛋白是豬傳染性胃腸炎病毒纖突的主要成分之一，在病毒粒子的表面，該蛋白基因全長4.3kb，蛋白分子量為195～220ku；S蛋白不僅是決定豬傳染性胃腸炎病毒抗原的重要結構，也影響著病毒對細胞的致病性、親嗜性等。M蛋白是構成病毒粒子蛋白的主要有效成分之一，研究表明[5]，M蛋白前體是由膜外區、信號肽、極性區、跨膜區突于病毒粒子內C-端區等功能區域構成，分子質量為29～31ku；M蛋白不僅決定了病毒粒子的出芽位點和裝配位點，也可以影響病毒變異。N蛋白是一種酸性蛋白質，分子量為47KDa，含有382個氨基酸殘基，該蛋白不僅是豬傳染性胃腸炎病毒的結構蛋白，同時對病毒基因組的加工、復制都具有重要作用。sM蛋白分子質量為78ku，含有1種小膜蛋白和82個氨基酸殘基，該功能蛋白在抗豬傳染性胃腸炎病毒感染的體液和細胞免疫中具有重要作用。

3 分子生物學檢測方法

3.1 核酸探針 核酸探針檢測方法的基本原理是利用核苷酸堿基互補，在堿基互補過程中，采用標記物標記與被檢測靶序列互補的單鏈核酸分子，進而檢測到目的核序列。該檢測方法與掃描電鏡、熒光抗體試驗、病毒分離等相比，具有較好的特異性，并且可以實現快速檢測的目的。現代研究表明[6]，不同的病毒探針可以分別擴增出與其對應的病毒模板，對其他病毒模板影響不大，同時核酸探針擴增的最低檢測限為3 000～6 000個拷貝的單個病毒核酸，具有較高的特異性和敏感性。

3.2 普通RT-PCR方法 該檢測方法使用的首要條件是知道被檢測病原的相關目的基因序列，根據相關目的序列后，采用相關軟件設計相應的引物，然后進行體外擴增目的基因，進而達到檢測的目的。王黎等[7]采用RT-PCR方法檢測豬傳染性胃腸炎病毒，并采用相同濃度做重復性檢測，結果顯示RT-PCR擴增的特異性條帶為590bp左右；然后又以豬瘟病毒、豬細小病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬偽狂犬病病毒以及豬輪狀病毒做特異性試驗，結果顯示僅有豬傳染性胃腸炎病毒得到了特異性目的條帶，所以RT-PCR檢測方法對豬傳染性胃腸炎病毒檢測具有較好的重復性和特異性。

3.3 多重RT-PCR方法 多重RT-PCR檢測方法是以普通PCR為基礎發展的一種新型檢測方法，該檢測方法可以在一個PCR反應體系中加入多對引物，并通過采用優化后的PCR反應條件，達到同時檢測多種病原的目的，具有快速、成本低等優點，目前也常用于各種疾病的診斷。霍金耀等[8]建立了多重RT-PCR法檢測傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、嵴病毒和A群輪狀病毒的方法，并對該檢測方法進行了敏感性試驗和特異性試驗，結果顯示，多重RT-PCR法可以檢測出50TCID50的混合病毒，且能擴增出長度為275bp、544bp、750bp的3條特異性片段，具有較高的特異性和敏感性，可以在臨床上推廣使用。

3.4 套式PCR方法 套式PCR方法需要設計內、外2對引物，并通過2次擴增對樣品進行檢測，該方法相對其他PCR檢測方法，具有較高的敏感性，且節約成本。現代研究表明，PCR技術在檢測病毒時，可以省略不同病毒分離的過程，具有較高的敏感性和特異性，而套式PCR方法在病毒粒子較少的情況下依然能夠檢測出，表明套式PCR比常規PCR具有更好的敏感性。沈海娥等[9]采用套式PCR檢測豬呼吸道冠狀病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的S基因序列，根據兩組病毒的基因序列分別設計了2對引物，然后分別以豬呼吸道冠狀病毒細胞和豬傳染性胃腸炎病毒細胞為模板進行套式PCR特異性片段擴增，結果顯示，豬呼吸道冠狀病毒擴增的基因片段為214bp，豬傳染性胃腸炎病毒擴增的基因片段為886bp，同時檢測出了這種病毒，具有較高的特異性和敏感性。

3.5 熒光定量RT-PCR方法 熒光定量RT-PCR檢測方法的原理是在PCR反應體系中采用熒光探針標記法或加入了SYBR GreenI熒光染料標記PCR的反應產物，然后使用反應儀器收集反應產物的熒光信號，并根據熒光信號的強弱確定產物的量，進而達到與起始模板準確定量的目的。該檢測方法與常規RT-PCR相比，不需要進行電泳試驗檢測PCR反應產物，反應結果更為直觀、方便，同時又避免了因電泳試驗對環境造成污染。王建中等[10]根據豬傳染性胃腸炎病病毒的S基因序列設計了引物，并通過多組試驗對熒光定量RT-PCR反應條件進行優化，結果顯示，優化后的檢測方法對其他病原的檢測結果均為陰性，檢測結果的敏感性高達43.07拷貝/μL，是常規PCR檢測方法的100倍，具有較高的敏感性和特異性。

3.6 環介導等溫擴增技術 環介導等溫擴增技術是近幾年新興的一種分子生物學檢測方法，因其具有特異性強、敏感性高、檢測速度以及操作簡單等優點，目前已經廣泛應用于病毒病和細菌病檢測。高睿澤等[11]根據豬傳染性胃腸炎病毒的N基因建立了環介導等溫擴增快速檢測方法，并對該檢測方法的敏感性和特異性進行了評價，結果顯示，該方法在63℃下可以使豬傳染性胃腸炎病毒N基因獲得較高的特異性擴增，且與豬流行性腹瀉病毒等物交叉反應，具有加高的特異性；同時該檢測方法可以檢測到131.4fg/μL的DNA，其靈敏度比常規PCR高出3個數量級。

參考文獻

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[9]沈海娥，郭福生，龔振華，等.應用套式PCR檢測和區分豬傳染性胃腸炎病毒和豬呼吸道冠狀病毒的試驗[J].中國動物檢疫，2003，20（7）：21-23.

[10]王建中.豬傳染性胃腸炎病毒S基因實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及初步應用[J].中國畜牧獸醫，2014，41（1）：66-71.

[11]高睿澤，白云云，李訓良，等.豬傳染性胃腸炎病毒RT-LAMP檢測方法的建立及應用[J].中國獸醫科學，2015，5（6）：572-577.

（責編：張宏民）