二氧化碳跨生物膜的傳遞機制研究進展

姜忠義，張寧，黃彤，任燕雄，王磊，王少飛

（1天津化學化工協同創新中心，天津 300072；2天津大學化工學院綠色合成與轉化教育部重點實驗室，天津300072）

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二氧化碳跨生物膜的傳遞機制研究進展

姜忠義1,2，張寧1,2，黃彤1,2，任燕雄1,2，王磊1,2，王少飛1,2

（1天津化學化工協同創新中心，天津 300072；2天津大學化工學院綠色合成與轉化教育部重點實驗室，天津300072）

摘要：二氧化碳（CO2）作為生物體內的代謝產物和反應底物，其與外界環境的氣體交換是保證生物體正常生命活動的重要基礎。CO2在生物體尤其是細胞內的傳遞對于控制碳排放、構建高效碳循環、開發新型碳捕集技術具有重要意義。本文對生物體內CO2的傳遞機制進展進行了綜述，重點介紹了CO2跨膜運輸的不同方式與相應機制，針對水通道蛋白對CO2的促進傳遞作用進行了較為詳細的分析，指出在膜對CO2自滲透性低時水通道蛋白對CO2的跨膜運輸才能發揮重要作用。近期研究進展表明，水通道蛋白四聚體的中央孔道和水通道賦予其對CO2的促進傳遞作用。此外，碳酸酐酶和HCO3–-Cl–轉運蛋白的存在能加速細胞內酸化過程，提高CO2的傳遞速率。期望本綜述能夠為開發新的仿生膜材料及其碳捕集技術提供理論方面的一些參考。

關鍵詞：二氧化碳；生物膜；溶解擴散；水通道蛋白；促進傳遞

第一作者及聯系人：姜忠義(1966—)，教授，博士生導師，主要從事仿生與生物啟發下的膜與膜過程研究。E-mail zhyjiang@tju.edu.cn。

碳是生物體的物質骨架，也是化石燃料的核心元素。1850年以來，化石燃料的快速消耗以及CO2的累積排放正在引發日益嚴重的全球氣候變化及環境問題[1]。如何解決工業生產中產生的CO2的大規模捕集、貯存和轉化，從而構建綠色、高效的碳循環是世界各國政府迫切關心的重大問題[2]。

CO2在細胞與內環境之間以及生物與外界環境之間存在氣體交換，動物、植物和絕大多數細菌進行呼吸作用產生的CO2需要排出體外，含葉綠素的生物進行光合作用需要CO2作為碳源，生物通過水合CO2的方式形成H2CO3–-HCO3–酸堿緩沖對，酸堿緩沖對所產生的CO2濃度梯度為其交換提供驅動力[3]。可以說，CO2的有效傳遞對生物體生理機能的實現不可或缺，生物體的各個部位、每時每刻都在發生著CO2的不同方式的傳遞。

CO2在生物體內的傳遞可以分為兩類。一是CO2的相際傳遞與均相擴散；二是CO2的跨膜傳遞。前者如植物葉中CO2通過氣孔進入疏松組織的細胞間隙，CO2通過毛細管孔道進入血漿等，其過程遵循菲克第一定律。后者如CO2穿過質膜、葉綠體、線粒體膜進出等，CO2在生物體的傳遞阻力主要集中在這一部分[4]。跨膜傳遞過程的實際傳遞速率比基于傳統的氣體傳遞機制（主要為自由擴散）或者理論計算的傳遞速率低幾個數量級[5]。

近年來，許多研究認為水通道蛋白能促進CO2的跨膜運輸[6-7]，然而也有一些不同的學術觀點。本文闡述了CO2在生物體內的傳遞機制研究進展，介紹了CO2在體內的傳遞途徑，重點分析了CO2自由擴散和水通道蛋白對CO2的促進傳遞，同時也介紹了碳酸酐酶與HCO3–-Cl–轉運蛋白對于CO2跨膜運輸的促進作用，以期為碳捕集技術和先進膜材料的研究開發提供一些可供參考的基礎理論。

1　CO2在生物體內的傳遞途徑

在健康動物體內，細胞和外界環境之間CO2濃度梯度很大[8]；相比之下，在進行光合作用的植物體內，CO2濃度梯度并不甚顯著。因此，在正常生理條件下，CO2由外界環境運輸至細胞內化學反應特定位點的過程中，相同的阻力對植物體內CO2傳遞產生的影響要大于其對動物體內CO2傳遞產生的影響。所以這里以植物體內CO2的傳遞為例來敘述CO2在生物體內的傳遞過程。

光合作用是植物體最基本也是最重要的生理活動[9]。一方面，氣孔的存在是CO2傳遞阻力的一個來源；另一方面，CO2由氣孔運輸至葉綠體內部存在內導（gi，也稱葉肉導度），這是CO2傳遞的另一個限制步驟，而后者對光合作用的阻礙作用通常比前者更為顯著。盡管gi受諸多因素影響，但最新的一些研究證明水通道蛋白是其中最為重要的影響因素[10]。HvPIP2;1是大麥體內的一種水通道蛋白，將HvPIP2;1引入水稻植株體內，這種轉基因水稻大量表達HvPIP2;1，其內導和普通水稻相比增加了40%[11]。這是第一個證明內導和水通道蛋白有直接關系的研究發現。

由外界環境運輸至葉綠體基質內化學反應的特定位點是CO2傳遞的全部途徑（圖1），它受限于細胞不同部位的阻力[12]。1為葉片中的氣孔；2為細胞間隙；3為細胞壁；4為細胞膜；5為細胞質基質；6為葉綠體。2至6步共同組成了CO2傳遞的內導gi。環境中的CO2必須經過細胞間隙、細胞壁、細胞膜，透過葉綠體被膜，進而運輸至葉綠體基質。圖中表示了CO2的自由擴散（左側）和依靠水通道蛋白進行傳遞（右側）兩種路徑。表1給出了每項阻力的大小和CO2從一個部位運輸至另一部位后對CO2濃度產生的影響。由表1可見，CO2在細胞膜和葉綠體被膜等膜結構中的傳遞阻力為總阻力的主要構成部分。此外，葉肉導度還與葉的形態、細胞壁厚度、胞質層結構、葉綠體表面積等因素有關，也會隨葉片溫度或水壓的變化而變化[13]。葉肉阻力能顯著減少葉綠體中CO2的濃度并因而降低凈光合作用，各阻力項的改變會直接影響CO2傳遞速率的大小。

圖1 CO2由外界環境運輸至葉綠體內部的傳遞途徑

表1 CO2在植物體內的傳遞阻力及濃度變化

由CO2的傳遞途徑可發現，CO2的跨膜運輸方式主要為被動運輸，包括CO2的自由擴散和借助于水通道蛋白的促進傳遞。CO2的跨膜運輸主要由兩種機制調控：一是依靠具有疏水性的生物膜磷脂雙分子層，遵循溶解擴散機制；二是依靠一類特殊的膜轉運蛋白（如水通道蛋白），遵循促進傳遞機制。

2　CO2的自由擴散

CO2分子屬于非極性小分子，其熱運動使CO2分子以自由擴散（又稱簡單擴散）的方式，沿濃度梯度降低的方向，通過生物膜從一側到達另一側。一般認為，該跨膜運輸方式屬于物理過程，遵循溶解擴散（solution-diffusion）機制，即CO2首先溶解在磷脂雙分子層中，再從膜一側擴散至另一側。因此，CO2滲透性的大小，不僅取決于CO2在磷脂雙分子層中的溶解性大小，還取決于其在磷脂雙分子層中的擴散阻力。生物膜對CO2的滲透性可以用滲透系數（P）來表示[14]，滲透系數可根據CO2在脂類和水中的溶解度系數（S）及在膜內的擴散系數（D）來計算，關系式為P=S×D。

研究者針對CO2在膜中的溶解擴散機制，建立了溶解擴散模型[15]。該模型認為CO2在膜中的自由擴散分為3個步驟，包括CO2在膜表面吸附溶解、CO2在濃度梯度的推動下向滲透側擴散、CO2在膜滲透側解吸。其中，吸附溶解和解吸過程能迅速達到平衡，而擴散過程往往較慢，構成CO2在膜內傳遞的控制步驟[16]。此模型中的溶解機制僅涉及物理溶解，不包括化學溶解。擴散機制由氣體分子性質和膜結構特性兩方面因素決定：在氣體分子性質層面，CO2分子為線性分子，動力學直徑約為0.33nm，因此在生物膜中的擴散優先于N2、NH3等氣體；在膜結構特性層面，生物膜的自由體積孔穴越多、自由體積分數越大，CO2的擴散速率就越大[17]。

在生物膜中，膽固醇的含量會在很大程度上影響膜對CO2的滲透性。隨著生物膜中膽固醇含量的增加，CO2的滲透性下降。實驗發現，當膽固醇的含量由0增加至50%時，CO2的滲透系數降低了2~3個數量級，而CO2的溶解度系數只降低了25%[18]。因此認為，CO2的擴散系數對其滲透性的影響比溶解度系數對滲透性的影響要大，膽固醇含量的增加降低了生物膜的流動性，使膜中CO2的擴散系數降低。細胞可以通過控制膽固醇的含量在較大范圍內調節CO2的滲透性，以滿足相應的生理功能。

3　水通道蛋白對CO2的促進傳遞

除了自由擴散外，CO2在生物膜內還存在其他傳遞途徑，其傳遞機制也明顯區別于溶解擴散機制。ZEIDEL等[19]考察了細胞膜的流動性對CO2滲透性的影響，發現不同流動性的膜對CO2滲透性相似，表明此情形下自由擴散不應該是CO2傳遞的主要方式。只依靠溶解擴散機制來傳遞CO2難以滿足細胞內對CO2高傳遞速率的需求，研究發現CO2的另一種跨膜運輸方式是促進傳遞（facilitated transport）需要生物膜上轉運蛋白的協助，其中最主要的一種就是前面提及的水通道蛋白。

水通道蛋白（也稱水孔蛋白，aquaporin，簡稱AQPs），是指具有水、不帶電小分子（尿素、硼酸、硅酸）或氣體（氨、CO2）等底物特異雙向滲透性的一類膜通道蛋白（26～34kDa）[20]，也稱MIPs，普遍存在于動物、植物及微生物中。對于AQPs是否能顯著促進CO2的跨膜運輸，研究者之間存在很大爭議。一種觀點認為，CO2的自由擴散本身十分快速，因此任何膜蛋白（如水通道蛋白）的存在都會減小CO2的傳遞速率，故水通道蛋白對CO2的傳遞現象不太可能真正存在[21]。另一種觀點認為，實驗測量得到的CO2傳遞速率比理論分析上低得多[22]，水通道蛋白可作為一種傳遞CO2的載體，可能與CO2分子之間發生可逆的化學反應，進而促進CO2通過生物膜的傳遞，此謂促進傳遞現象[23]。水通道蛋白對CO2的促進傳遞為生物體內CO2的高傳遞速率提供了保證。

盡管對AQPs是否能促進CO2的跨膜運輸依然存在爭論，但許多研究證明水通道蛋白能顯著促進CO2的跨膜運輸。1995年，TYERMAN等[24]發現，AQPs能促進CO2通過細胞膜，同時表明這對于減少CO2在細胞內的傳遞阻力和在1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的光合作用中是重要的。1998年，BORON 等[25]發現在爪蟾卵母細胞中引入水通道蛋白（AQP1）后CO2的滲透系數得到了明顯提升，使用HgCl2（水通道抑制劑）后水通量和CO2通量明顯降低，從而認為AQP1可以作為CO2通道。2003年，UEHLEIN等[26]的研究發現，不僅在爪蟾卵母細胞中表達的煙草NtAQP1能促進CO2跨膜運輸，在煙草植株中表達的NtAQP1也有該促進作用。2010年，SKELTON等[27]將AQP1引入腎臟中，發現AQP1可將周圍的CO2迅速傳遞，具有良好的平衡酸堿能力。2012年，NORBERT等[28]通過在嵌段共聚物（不透CO2）中引入水通道蛋白，從而驗證了CO2在膜中的促進傳遞。

在水通道蛋白對CO2跨膜運輸作用的研究中，AQP1是眾多研究者研究最多的一種水通道蛋白，又因各水通道蛋白的三維結構相似，故以AQP1為代表闡述水通道蛋白對CO2的傳遞。水通道蛋白對底物的選擇性取決于其內部氨基酸的性質[29]。在脂質雙分子層中，AQP1運輸CO2可能的途徑有兩種：一是通過AQP1四聚體形成的中央孔道；二是通過AQP1單體中的水通道。其中更多研究者認同的傳遞方式為通過四聚體中央孔道的傳遞。

3.1 四聚體中央孔道對CO2的傳遞

在細胞膜中，AQP1主要以同源四聚體的形式存在，且每一個單聚體是一個獨立的功能單元。圖2為水通道蛋白分子的拓撲結構示意圖。一個AQP1單體分子是一條單肽鏈，由6個貫穿細胞膜兩側的長α螺旋構成基本骨架，6個長α螺旋由5條環（A～E loop）相連。4個單體銜接處中心形成一個縫隙，即四聚體的中央孔道。圖3為AQP1四聚體的結構簡圖，由于疏水性，中央孔道不能傳遞水分子[30]。

圖2 水通道蛋白分子的拓撲結構示意圖

圖3 AQP1四聚體結構簡圖

一些研究者的模擬結果[31]發現，CO2在水通道蛋白內的傳遞有兩道阻力屏障：第一道屏障位于靠近細胞表層的位置，周圍有4個Val-50（來自于4個單體）；第二道屏障距離第一道屏障約為7 ?，周圍有4個Asp-48。CO2和水在與Asp-48形成氫鍵的過程中產生競爭關系，且CO2分子和Asp-48之間的氫鍵作用力是可逆的，故CO2得以透過中央孔道。

另外，一旦中央孔道內存在離子或有機分子，那么CO2通過中央孔道的阻力就會大大增加。DE-GROOT等[32]認為，在紅細胞、哺乳動物肺部或其他組織中，AQP1對于CO2的促進傳遞主要依賴于膜結構自身對CO2的滲透性。只有當膜對CO2的活化能壘超過20 kJ/mol或者四聚體的中央孔道內不存在離子或有機分子時，AQP1的促進傳遞方式才在所有跨膜運輸方式中發揮主要作用。換言之，只有在膜對CO2自滲透性很低的情況下，AQP1的促進傳遞才發揮出重要的生理作用[33]。

3.2 水通道對CO2的傳遞

水通道蛋白的三維結構——“沙漏模型”[34]指出：B環和E環具有高度保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸（Asn-Pro-Ala，又稱NPA）特征性序列，B環、E環折返進入雙分子層，2個NPA序列在膜中間位置相互結合，6個跨膜螺旋包圍在四周，共同構成AQP1的水通道。NPA序列的兩個脯氨酸殘基之間存在范德華力，此作用力對于短螺旋HB和HE的折疊有穩定作用[35]。水通道最窄處稱為芳香/精氨酸（ar/R：aromati/arginine）保守域，由4個殘基構成，包括親水His180、Arg195、Cys189和疏水Phe56（圖4）。

HUB等[36]模擬了磷脂雙分子層中AQP1對CO2的滲透性，研究發現，CO2分子在ar/R保守域中的傳遞阻力為23±4 kJ/mol；在NPA結構域中的傳遞阻力較小，為9±1 kJ/mol。在ar/R保守域中，水分子和Arg-195之間形成很強的氫鍵，這在一定程度上對CO2的傳遞存在不利影響。在晶體結構中，Arg-195的胍基正好伸入孔道，使其成為通道中最窄的部位[37]。CO2要通過此部位，須破壞水分子和Arg-195的N原子之間的氫鍵，如此一來，CO2的傳遞阻力會大大增加。然而，Arg-195的結構多變性對ar/R保守域的阻力有很大影響，即Arg-195的位置和殘基結構可在一定范圍內有微小變動，這種結構多變性很可能源于C環的結構多變性[38]。Arg-195依靠鄰近的Asn-127與Gly-125形成的氫鍵維持穩定性，如果在CO2的跨膜傳遞過程中，水分子和Arg-195形成的氫鍵不發生斷裂，CO2通過ar/R保守域的傳遞阻力會相應降低。BEITZ等[39]的研究發現，在短螺旋HB和HE末端的兩個天冬酰胺可作為氫供體，可能與底物分子（如CO2）中的氧原子相互作用，降低CO2傳遞的能壘。

圖4 AQP1的ar/R保守域和NPA結構域示意圖

水通道的限域效應也為CO2的選擇性透過提供了一定的保證。AQP1水通道中ar/R保守域的4個氨基酸殘基構成的狹口直徑大約為2.8? （1?=0.1nm），恰好為一個水分子的大小，而CO2分子為線性分子，且一個CO2分子的直徑比水略小[40]，故CO2可能通過水通道。據模擬計算，CO2通過AQP1水通道的傳遞阻力與在水相中比較要大一到兩個數量級。

OTTO等[41]對表達NtAQP1的酵母細胞進行了研究，發現AQP1的四聚體相比于單體有更高的CO2傳遞速率，這與CO2通過四聚體中央孔道進行傳遞的觀點相一致，此傳遞方式也是目前研究者較為認同的一種。關于AQP1內是否還有其他CO2通道的疑問還有待進一步證實[42]。

4　其他蛋白質對CO2傳遞的作用

4.1 碳酸酐酶對CO2傳遞的促進作用

碳酸酐酶（carbonic anhydrases，簡稱CA），在生物體內廣泛存在，如哺乳類動物、植物、藻類和細菌。它是一類含鋅金屬酶，能可逆地催化CO2與HCO3–的相互轉化[43]。反應見式(1)。

其作用主要通過碳酸酐酶活性區域一系列氨基酸殘基及與這些殘基配位的Zn2+來實現。因此，CO2的傳遞速率取決于傳遞路徑長度（如曲折度、體積排阻）和碳酸酐酶CA的活性[44]。

以CAⅡ的結構為例，其活性區域位于β鏈形成的約15?的空腔中，Zn2+位于活性區域底部，且與氨基酸殘基His94、His96和His119的季銨氮原子配位，并與H2O或OH–連接形成四面體結構[45]。這些Zn2+的直接配體能通過氫鍵供體與CA中具有氫鍵受體的殘基相連，這些氫鍵受體稱為非直接配體。直接配體與非直接配體相互作用，形成一個氫鍵網狀結構，該結構能夠增強Zn2+的穩定性，加強H2O、OH–對CO2的親核作用，更好地固定CO2，從而使酶的催化作用更高效。

CAⅡ的水合機制如圖5所示。CAⅡ對CO2的催化分為兩步[46]：①與Zn2+相連的H2O去質子化形成EZnOH，EZnOH–能親核進攻CO2，形成EZnHCO3–，HCO3–被H2O取代形成EZnH2O；②EZnH2O經酶中的質子轉運體將H+轉運至溶劑中，其轉運是通過活性區域的His-64來實現的，同時還原生成有催化活性的EZnOH–。

4.2 HCO3–-Cl–轉運蛋白對CO2傳遞的促進作用

對人體紅細胞膜的研究發現，Cl–通道阻斷劑DIDS（4,4?-diisothiocyanato- stilbene-2,2?-disulfonic acid）降低了紅細胞膜的CO2滲透性[47]，這表明，紅細胞膜中的HCO3–-Cl–轉運蛋白與CO2的傳遞有關。

圖6為CO2進入人體紅細胞的不同路徑，包括自由擴散、通過AQP1和通過HCO3–-Cl–轉運蛋白3種方式。CO2進入紅細胞以后，HCO3–-Cl–轉運蛋白末端的CAⅡ催化CO2水合，進而轉化成HCO3–和H+。H+通過Na+-H+載體蛋白轉運出細胞膜，而HCO3–通過HCO3–-Cl–轉運蛋白轉運出紅細胞[48]。HCO3–-Cl–轉運蛋白的轉運作用提高了CO2的傳遞速率，加速了細胞內的酸化過程。

綜上所述，在CO2濃度梯度較小的情況下，水通道蛋白和HCO3–-Cl–轉運蛋白有可能成為CO2的高親和位點，同時碳酸酐酶CA的存在加速了CO2的催化過程，三者對于CO2的跨膜運輸均具有重要作用。

圖5 CAⅡ的水合機制

圖6 CO2進入人體紅細胞的不同路徑示意圖

生物膜中的活性載體可以選擇性地促進CO2的傳遞，受生物膜中促進傳遞現象的啟發，可在分離膜中引入具有促進傳遞效果的載體，通過待分離組分（如CO2）與載體之間發生可逆化學反應而實現分離強化的目的，這樣的膜稱為促進傳遞膜[49]。促進傳遞膜在一定程度上更接近于生物膜，與傳統分離膜相比具有很高的選擇性和較高的滲透性。因此，CO2促進傳遞膜在碳捕集領域具有重要應用前景[50]。

5　結 語

CO2在生物體內的傳遞速率依賴于生物體細胞不同部位的傳遞阻力，其中跨膜運輸的阻力在總傳遞阻力中占主要地位。盡管CO2跨膜運輸的機制仍存在科學上的較大爭議且很難在短期內得出統一性的結論，但研究發現脂質雙分子層運輸CO2的規律并不適用于所有生物體內的所有生物膜。CO2的跨膜運輸既包含物理機制（溶解擴散機制），同時包含化學機制（促進傳遞機制）。換言之，除了自由擴散以外，很大程度上還與水通道蛋白有關，且只有在膜對CO2自滲透性低的情況下，水通道蛋白對CO2的促進傳遞才顯示出重要作用。水通道蛋白運輸CO2有兩種可能的途徑，即四聚體的中央孔道和水通道，其中研究者更為認可的途徑為四聚體的中央孔道，關于水通道蛋白內是否存在其他的CO2通道還有待證實。此外，碳酸酐酶能催化CO2的水合反應，某些細胞膜（如紅細胞膜）中的HCO3–-Cl–轉運蛋白的轉運作用也提高了CO2的傳遞速率，促進了CO2的跨膜運輸。

從分子層面上揭示CO2的傳遞機制，分析氣體分子如CO2如何進出細胞、組織和生物體，需要借助實驗技術、分析表征技術與模擬計算技術的共同發展來實現。上述研究進展對于設計新型仿生膜材料、開發高效的碳捕集技術具有重要和深遠的意義。

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Research progress on the transfer mechanisms of CO2across biological membranes

JIANG Zhongyi1,2，ZHANG Ning1,2，HUANG Tong1,2，REN Yanxiong1,2，WANG Lei1,2，WANG Shaofei1,2
（1Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering（Tianjin），Tianjin 300072，China；2Key Laboratory for Green Chemical Technology of Ministry of Education，School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China）

Abstract：CO2，as a vital metabolic product and reaction substrate in living organisms，can make gas exchange with external environment，which is crucial to ensure the normal physiological activities of living organisms. The transfer of CO2in organisms，especially in cells，is of great significance for controlling the emission of CO2，constructing efficient carbon cycle and exploring the carbon capture technology. This review presents a brief overview of the research progress on CO2transport mechanisms in organisms，including the detailed analysis of different models about the CO2transmembrane transport mechanisms，and in particular the facilitated transport of CO2by aquaporin protein，with the conclusion that the aquaporin-mediated CO2permeation plays an important role in membrane with a low intrinsic CO2permeability. Recent researches also show that the water channels and central pore along the fourfold axis of the tetramer of aquaporin are supposed to function in the CO2transmembrane transport. Moreover，the existence of carbonic anhydrase and HCO3–-Cl–transporter can accelerate intracellular acidification process，thus increase the CO2transmembranetransport rate. This review could offer theoretical reference for developing newbiomimetic membrane materials and carbon capture technology.

Key words：carbon dioxide；biofilm；solution-diffusion；aquaporin；facilitated transport

中圖分類號：Q 241

文獻標志碼：A

文章編號：1000–6613（2016）06–1845–07

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.06.026

收稿日期：2016-01-29；修改稿日期：2016-03-12。

基金項目：國家自然科學基金（91534126）、國家高技術研究發展計劃（2012AA03A611）及國家杰出青年科學基金（21125627）項目。