生物制造過程中的微生物生長與調控

侯慧，李春

（北京理工大學生命學院生物工程系，北京 100081）

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生物制造過程中的微生物生長與調控

侯慧，李春

（北京理工大學生命學院生物工程系，北京 100081）

摘要：提高生物基產品的產量和生產效率是生物制造發展的目標。由于微生物具有生長快、營養要求簡單和基因操作簡便等特點，常用作生物基產品制造過程中的底盤宿主，因此，產品制造過程中微生物細胞的生長與調控尤為重要，其生長調控會直接或間接地影響生物基產品的合成效率。微生物的生長不僅受外界環境如溫度、溶氧量、pH等的影響，而且還受微生物本身的生長與調控機制如細胞分裂調控、必需基因表達調控、程序化死亡等的影響。本文綜述了利用分子生物學、合成生物學和系統生物學等方法對微生物細胞生長和分裂過程進行分子調控，以提高生物反應速率和目標產物的產量，為化工、食品、生物醫藥以及環境保護等領域構建高效的生物制造工藝提供新思路。

關鍵詞：生物制造；細胞生長；分裂調控；必需基因；程序化死亡；生物產業

第一作者：侯慧（1989—），女，碩士研究生。E-mail 39houhui@sina.com。

聯系人：李春，教授，研究方向為生物催化、酶工程、生物反應、生物能源。E-mail lichun@bit.edu.cn。

隨著科學技術的不斷發展，生命科學和生物制造技術取得突破性進展，生物基產品的生產技術不斷進步，產品質量不斷提高，生物制造產業快速發展。生物制造是生物技術與工業制造技術相融合交叉形成的一個新興制造領域，將現代生物技術和生命科學應用于生產和經濟社會相關領域，為社會提供商品和服務，主要包括生物基化學品、生物醫藥、生物能源和食品等。我國已建成與生物制造研發相關的20家國家工程研究中心、15家國家工程實驗室和40家國家級企業技術中心，并逐漸形成一定規模的生物制造體系。我國科研人員在微生物基因組工程技術、代謝工程技術、合成生物技術等方面不斷取得創新突破，一批大宗發酵產品的國際競爭力實現了大幅提升，創造了巨大的經濟與環境效益，多種生物產品的生產技術達到了國際領先水平，生物制造的發展正在為世界經濟增長注入新的活力，加速了生物產業化發展進程，預計到2025年，全球生物基產品的產值將超過5000億美元[1-3]。

但是在生物制造發展過程中，還有許多關鍵問題和技術難點沒有得到很好的解決，有待于進一步去探討。生物制造過程涉及動物、植物和微生物細胞的生長與調控，其中90%以上利用微生物代謝用于生產。微生物生長快、種類多、特性廣，在長期進化過程中形成了完整的代謝調節系統[4]，為生物制造的發展提供了基礎材料和豐富的基因資源。另外，微生物基因組較小、簡單易操作，以微生物代謝為基礎的生物制造可以巧妙地通過基因組的設計、改造和再設計來創造新的工藝和合成更多的產品，為生物制造過程開辟了新天地。由于微生物的生長調控與高效生物制造密切相關，是生物制造過程中的關鍵控制點，因此，通過調控微生物生長可以直接、高效地提高其代謝過程中酶的活性和物質轉化效率，進而提高生物制造過程中產品的產量和生產效率。然而，微生物細胞的生長不僅受外界環境如溫度、溶氧量、pH等的影響，而且還受微生物本身的生長與調控機制如細胞分裂調控、必需基因表達調控、程序化死亡等的影響，本文將從微生物細胞生長與調控的分子機制來綜述如何調節和提升生物制造水平。

1　產物合成與微生物生長

表1 生物制造產品舉例

隨著當代生物科學特別是生物化學、分子生物學、基因工程、細胞生物學等學科技術與理論的成熟，人們對核酸、蛋白質、多糖、生物膜等大分子的研究已經達到新的廣度和深度，如果將上述成果應用到工程制造領域，那么人們將進入一個全新的生物技術時代——生物制造。生物制造產品舉例見表1。生物制造應用現代生物技術進行大規模物質加工與轉化，以微生物細胞或酶蛋白為催化劑進行化學品合成，并應用于化工、食品、醫藥、材料、能源和環保等領域。近年來，全球生物材料和化學品迅猛發展，生物基產品合成的基礎研究已經具良好的基礎，關鍵技術已經初步形成，DNA測序和快速合成、蛋白組學技術尤其是合成生物學的發展加快了生物制造的產業化進程，特殊微生物、酶的開發使得生物資源的利用趨于多樣化、智能化和集成化，越來越多的大宗化學品、精細化學品正在逐步向生物基產品的生產模式過渡，生物制造的產業化發展格局趨于形成。1,3-丙二醇、3-羥基丙酸、丁二酸、類異戊二烯、1,4-丁二醇、異戊醇、丙烯酸等傳統化工產品的生物制造路線已經建立，生化纖維及生物塑料等產品已進入產業化應用，生物制造以其原料來源廣泛、可再生、加工方式清潔、高效并且環境友好的優勢，將成為傳統化工產業的有益的補充和完善。

生物制造過程控制在生產中發揮著掌控全局的作用，并且對微生物代謝過程中關鍵酶的活性、中間產物合成、代謝流的平衡和產品合成效率等有重要影響，因此，科學可行的過程控制措施是生物制造的重要內容之一。生物制造的過程控制包括環境參數如溫度、pH、溶氧量和營養等以及細胞內部的代謝參數如關鍵酶的改造、代謝途徑的重構與優化、細胞生長與調控等，其中微生物細胞生長與調控是主要的影響因素，是微生物代謝變化的反映和單細胞生產能力的衡量標志，對目標產物的合成效率有顯著影響。因此，在生物制造過程中微生物細胞生長的可控調節是生物制造過程控制的關鍵，通過調控微生物細胞生長地快慢來有效控制生物制造過程，以達到提高生物反應速率和目標產物產量的目的。細胞分裂是一切生物體生長、發育和繁殖的基礎，與細胞生長密切相關；必需基因是微生物不可或缺的基因，其突變或丟失通常會導致細胞死亡；微生物程序化死亡是維持其種群延續的一種方式。因此，在對微生物本身的生長調控機制進行研究的基礎上，采用分子生物學、合成生物學、系統生物學等方法對微生物細胞生長過程中關鍵基因進行調節，靈活地調控微生物細胞分裂、生長和死亡，以提高反應速率和目標產物的產量在生物制造領域具有廣泛應用。

2　微生物細胞的分裂調控與產物合成

細胞分裂是一個細胞分裂為兩個細胞的過程，是一切生物體生長、發育和繁殖的基礎，它保證遺傳物質在前后代細胞中的連續性和穩定性。大多數細菌、古細菌和單細胞真菌以二分裂方式進行分裂，圖1為細菌二分裂過程的一個周期[5]。細胞分裂過程中的功能蛋白已經被發現，但是這些蛋白的相互作用關系和精確控制細胞分裂的機制還有待進一步探索。

圖1 細菌細胞分裂周期[5]

在原核生物細胞分裂中起核心作用的是FtsZ蛋白，它由383個氨基酸組成，是細胞分裂的起始蛋白，并且發揮著細胞骨架的核心作用[6]。細胞正常分裂時，GTP能夠誘導FtsZ蛋白聚合，在細胞中部聚集形成Z環狀骨架，隨后FtsZ招募其他十多種膜結合蛋白在細胞中部組裝成環狀復合物，使一個細胞壓縮分裂成兩個子細胞，介導細胞分裂順利完成。2014年，荷蘭代爾夫特理工大學的MASHAGHI 等[7-8]研究了微生物細胞分裂過程中蛋白質之間的相互作用，這些蛋白質包括FtsA、EzrA、ZapA、SepF、ZipA、FtsE、FtsX、FtsK、FtsQ、FtsB、FtsL、FtsW、FtsI、FtsN、AmiC、EnvC等，表明正是這種復雜的蛋白網絡關系使得研究人員能夠利用現有的蛋白對細胞分裂進行調控，將這些蛋白質通過與FtsZ相互作用對Z環形成的影響可以分為正調控因子和負調控因子。

2.1 正向調控因子對細胞分裂的精細調控

微生物細胞分裂的正調控是指對分裂過程起穩定和促進作用。圖2為細胞分裂蛋白相互作用示意圖。正向調控因子包括FtsA、ZipA、ZapA、SepF、FtsE、FtsX和EzrA，它們通過與FtsZ蛋白相互作用參與細胞分裂的調節，穩定Z環的形成，促進細胞正常分裂。例如，ABC運載體FtsE和FtsX可以促進大腸桿菌細胞分裂，它們向大腸桿菌分裂位置的募集需要FtsZ、FtsA和ZipA，但不需要FtsK、FtsQ和FtsI[9]。而FtsA 和ZipA都是通過誘導FtsZ原絲形成集束來穩定Z環的形成，如缺乏其中任何一個蛋白會使細胞存活率降低，細胞變長。EzrA不是通過與FtsZ而是與FtsA相互作用來行使功能的，當細胞內EzrA蛋白含量下降時，枯草芽孢桿菌細胞長度明顯變長[10]。

圖2 細胞分裂蛋白相互作用

2.2 負向調控因子對細胞分裂的精細調控

微生物細胞分裂的負調控是指對細胞分裂過程起抑制作用。負向調控因子包括SulA蛋白、FtsH蛋白和Min系統，它們通過與FtsZ蛋白相互作用，阻止其聚合和Z環形成，細胞停止分裂變成長的絲狀。在研究SOS介導的細菌分裂時首次發現SulA對細胞分裂具有抑制作用[11]，它由169個氨基酸組成，是一個高度保守的細胞分裂抑制因子，可以直接與FtsZ相互作用導致GTP水解無法進行，阻止FtsZ聚合，產生不分裂的長絲狀細胞從而抑制細胞分裂[12]，當細胞暴露在逆境下時會產生SOS反應，誘導大量SulA蛋白表達，以避免受損的DNA傳給子代細胞。而FtsH是一種膜結合的、需要ATP的Zn2+金屬蛋白，是ATP酶家族中的一員，廣泛存在于真細菌、古細菌及真核細胞中，能夠降解膜蛋白和細胞質蛋白[13]，SRINIVASAN等[14]構建了7種FtsZ的N端或C端結構缺失的突變株，證明FtsH對突變株均有降解作用。

細菌細胞的分裂還受到Min系統的精細調控[15]。Min系統包括MinC、MinD和MinE基因，它們在細胞兩極上阻止FtsZ聚合，影響細胞分裂位點的確定，導致Z環定位異常，細胞不對稱分裂產生不含染色體的小細胞，同時還會使細胞分裂受到抑制，產生不分裂的長絲狀細胞。MinC蛋白由231個氨基酸組成，其N端含有FtsZ結合結構域，直接與FtsZ蛋白相互作用，抑制FtsZ蛋白的聚合，從而抑制細胞分裂[16]。MinC蛋白的C端含有MinD結合結構域，與其結合形成MinCD復合物，MinD蛋白由270個氨基酸組成，也可以與ATP結合形成復合體結合到細胞膜上[17]。2013年，DILLON等[18]發現oxyR基因能夠調控MinD的表達，其突變使MinD表達增加，導致細胞分裂隔膜無法形成，細菌細胞變長。MinE是一個小的功能蛋白，由88個氨基酸組成[19-21]，它在細胞中形成螺旋環狀結構，從細胞一極向細胞另一極移動，并驅動MinCD復合物在細胞兩極間移動。

2.3 細胞分裂調控產物的合成

聚羥基脂肪酸酯是一種可生物降解的環境友好型塑料，2014年，清華大學陳國強課題組[22]為提高聚3-羥基丁酸脂PHB和3-羥基,4-羥基脂肪酸共聚酯P(3HB-co-4HB)的產量，在大腸桿菌中過表達sulA使得大腸桿菌細胞形態呈長絲狀，不僅增大了細胞空間，而且使目標產物PHB和P(3HB-co-4HB)的產量與對照相比分別提高了104%和10%。另外，外界添加某些化合物如3-甲氧基苯甲酰胺能夠抑制ADP-核糖轉移酶，并作用于FtsZ，微弱地抑制枯草芽孢桿菌的分裂，導致細胞溶解[23]；血根堿能夠阻止FtsZ的聚集，干擾大腸桿菌和枯草芽孢桿菌細胞分裂過程中Z環的形成，具有抗菌活性[24]；紫杉烷類化合物能使結核分枝桿菌細胞形成長絲狀菌體，具有顯著的抗肺結核活性[25]；PARADIS-BLEAU 等[26]合成了一系列GTP類似物GAL，能夠像GTP一樣結合到FtsZ上，使得GTP水解無法進行，大腸桿菌生長受到抑制。

3　必需基因的調控與微生物代謝

必需基因是組成細胞結構、信息傳遞和加工不可或缺的，其突變或丟失通常會導致細胞死亡[27]。必需基因的數量和功能在不同種類的微生物中差別顯著，HUTCHISON等[28]通過基因定位插入失活分析，證明肺炎支原體中有387個必需基因，但其中28%的功能未知。日本和歐盟研究組[29]用相同的方法證明芽胞桿菌中有271個必需基因，它們是細胞生長、分裂、DNA復制、轉錄、翻譯、蛋白質折疊、能量轉化和物質代謝必不可少的。MORI課題組[30]通過單基因敲除證明大腸桿菌K12的4288個基因中有341個必需基因，其中有59個功能未知，具體見表2。

甾醇是釀酒酵母細胞膜的重要成分之一，也是細胞生長的重要物質，甾醇合成途徑是多酶體系參與的復雜過程，其中的角鯊烯合成酶編碼基因Erg9是釀酒酵母的必需基因，其敲除會導致細胞死亡。然而，PARADISE研究組[31]通過下調青蒿酸合成中分支途徑關鍵基因Erg9的表達，將目標產物青蒿酸的產量提高到了100mg/L。必需基因敲除或丟失對細胞生長通常是致死的，但是2014年清華大學陳國強課題組[32]對大腸桿菌中的細胞呼吸必需基因hemD進行敲除，發現大腸桿菌細胞并沒有全部死亡，而是仍有少量生長。2015年，哈佛醫學院MANDELL等[33]將大腸桿菌改造成營養缺陷體，在其基因組很多位置摻入了人工合成的氨基酸，使其必須依賴這些氨基酸存活，通過這種方法最終使得大腸桿菌的逃逸率降低到10–12。

表2 大腸桿菌K12的必需基因及功能

4　程序化死亡調控與微生物代謝

微生物在不良生長環境下可以自發地抑制生長速度，甚至會自發性死亡以維持整個種群的生存。1997年，德國蒂賓根大學的MADEO等[34]在研究釀酒酵母的細胞分裂周期基因cdc48時首次發現了這種現象，并稱之為真菌細胞凋亡；與真菌相似，細菌在生長繁殖過程中會表現出群體行為，為了維持菌群生存表現出與真菌細胞凋亡相似的特點，命名為細菌程序性細胞死亡。細菌和真菌的這兩種機制都是為了維持種群延續采取的一種利他方式，但是由于細菌和真菌的結構差異和生存環境的不同，它們程序化死亡的機制是有區別的。

4.1 真菌細胞凋亡

真菌細胞凋亡機制與細菌不同之處在于不存在細菌特有的毒素-抗毒素系統，研究發現，大約40%是由胱天蛋白酶介導的，而胱天蛋白酶非依賴的凋亡途徑主要與線粒體內的凋亡誘導因子和核酸內切酶有關。

4.1.1 細胞凋亡正調控機制

細胞凋亡的正調控是指對凋亡過程起促進作用。正調控因子包括細胞色素C、肌動蛋白、NADH氧化酶、核酸內切酶和活性氧自由基等，大部分通過激活胱天蛋白酶引起凋亡，它在真菌凋亡中起核心作用[35]。例如，細胞色素C是線粒體電子傳遞鏈的重要組成部分，通常位于線粒體膜間隙，在凋亡因素刺激下從線粒體釋放到胞漿與凋亡蛋白酶激活因子結合，誘導其變構并寡聚化形成寡聚體，進一步結合前胱天蛋白酶，激活胱天蛋白酶引發級聯反應，導致細胞凋亡[36]。肌動蛋白是構成細胞骨架的主要成分，其表達水平與細胞形態變化密切相關，細胞凋亡時，肌動蛋白網絡結構遭到破壞，導致線粒體膜電位去極化，細胞內活性氧自由基累積，而肌動蛋白穩定性的提高能明顯降低細胞內活性氧自由基水平，延長細胞壽命[37]。NADH氧化酶在能量代謝和氧化還原代謝中發揮作用，在凋亡因素的刺激下被某些蛋白酶水解，從線粒體釋放到細胞質中，然后被轉移到細胞核中，降解核DNA和質粒 DNA，引起DNA斷裂和染色體凝集，NADH氧化酶過表達可以促進過氧化氫所致的細胞凋亡[38]。活性氧自由基不僅可以氧化細胞內的生物大分子引起細胞損傷，而且可以激活胱天蛋白酶引起細胞凋亡[39]。

4.1.2 細胞凋亡負調控機制

細胞凋亡的負調控是指對細胞凋亡過程起延緩作用，凋亡抑制蛋白通過與胱天蛋白酶結合，抑制其與底物的結合，發揮抗凋亡作用。負調控因子包括凋亡抑制蛋白和超氧化物歧化酶等，例如，Bir1p是真菌中唯一的凋亡抑制蛋白家族成員[40]，其過表達可以保護細胞免受過氧化氫或衰老導致的細胞凋亡，在紡錘體穩定及細胞分裂中發揮重要作用。同樣，超氧化物歧化酶過表達可降低細胞中活性氧自由基的含量，延長細胞壽命[39]。

4.2 細菌程序性細胞死亡

細菌的程序性細胞死亡是由其自身的基因調控的，分為兩類：一類發生在細菌功能性分化時，另一類是由毒素-抗毒素系統介導的，近幾年的研究工作主要針對后者。

毒素-抗毒素系統由一對編碼特定組分的基因組成，下游基因編碼的毒素穩定，可以抑制細菌生長導致細胞死亡；上游基因編碼的抗毒素不穩定，可以使毒素失活。正常情況下這兩種物質在細菌體內維持動態平衡，不會對細胞產生毒害。毒素-抗毒素系統中的毒素是蛋白質，它通過影響細菌DNA的復制、mRNA穩定性、細胞分裂和ATP合成等多種方式發揮毒性作用，根據抗毒素種類的不同可以分為五種類型。類型Ⅰ中的抗毒素為不穩定的反義RNA分子，2013年NATALIE等[41]證實在枯草芽孢桿菌中，抗毒素SR4不僅會抑制毒素bsrG mRNA的翻譯，而且會促進毒素bsrG mRNA的降解。類型Ⅱ中的抗毒素為不穩定的蛋白質[42]，與毒素結合形成復合物抑制它的毒性作用。類型Ⅲ中的抗毒素為RNA，2013年SAMSON等[43]證實AbiQ蛋白是一種核糖核酸內切酶，在體內特異的切割其同源的抗毒素RNA。類型Ⅳ中的抗毒素為蛋白質，但是它不是和毒素形成復合物，而是直接抑制毒素在細胞靶點的作用來抑制它的毒性，2013年MASUDA 等[44]在大腸桿菌中發現了第一個Ⅳ型系統，毒素CbtA能抑制細菌骨架蛋白MreB和細胞分裂蛋白FtsZ的聚合，而抗毒素YeeU能夠增強它們的聚合。類型Ⅴ中的抗毒素為穩定的蛋白質，2012年WANG 等[45]首次發現了Ⅴ型系統，毒素GhoT可導致細胞死亡，抗毒素作為一種序列特異性的核酸內切酶切割GhoT的mRNA從而阻止其翻譯。

4.3 微生物程序化死亡調控群體數量

2015年，美國耶魯大學的GALLAGHER等[46]在大腸桿菌中構建了一個毒素-抗毒素基因線路，誘導型啟動子pBAD調控表達的EcoRI核酸內切酶通過剪切大腸桿菌基因組EcoRI位點使細胞死亡，同理，pLtetO調控表達的EcoRI甲基化酶能保護基因組上的EcoRI甲基化位點免受EcoRI核酸內切酶的切割，最終大腸桿菌的逃逸率僅為9.4×10–7，成功實現了對大腸桿菌細胞生長的調控。細菌程序性細胞死亡也是一種細菌群體感應調節產生的行為，細菌密度達到一定閾值時通過信號分子來啟動相關基因的表達，在合成生物學領域，群體感應被廣泛用來調節細菌的很多生理功能，例如毒素產生、質粒轉移和抗生素合成等。目前最普遍的群體感應分子是高絲氨酸內酯AHL，如圖3所示。1997年DENNY等[47]發現在青枯菌中存在一種群體感應分子3-羥基棕櫚酸甲酯可以調節青枯菌的密度；2000年DONG等[48]在芽孢桿菌240B1中克隆到了世界上第一個AHL內酯酶基因aiiA，它表達的蛋白可以水解AHL的內酯鍵，鈍化其活性并破壞病原菌群體感應信號傳導，使病原菌死亡；2005年PARK等[49]從鏈霉菌M664菌株中克隆到了能夠降解AHL的基因ahlM，表達的蛋白也能夠降低病原菌的毒性。

圖3 革蘭氏陰性菌的群體感應系統

5　外界環境對微生物生長的調控

影響微生物細胞生長的環境因素主要包括溫度、pH、溶氧量等，適宜的環境條件對細胞生長起促進作用，提高產品的合成速率和產量，而不良環境條件對微生物細胞的影響表現在以下幾個方面：抑制細胞的分裂及其生長，影響蛋白質合成使其變性聚集，破壞細胞骨架，阻斷細胞代謝，降低細胞活力等，最終導致細胞死亡。例如，在微生物呼吸過程中，氧氣還原為水的同時形成某些有毒的中間產物如過氧化氫、超氧陰離子等[50]，它們可直接作用于代謝途徑中關鍵基因的復制與轉錄，對微生物功能產生不利影響，使細胞處于死亡的邊緣。然而好氧微生物由于具有降解這些產物的酶，如過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶使得細胞不受破壞，嚴格厭氧菌由于缺乏這些酶，容易受其毒害致死。生物制造過程控制如圖4所示。

6　結 語

微生物細胞的生長與調控在產物合成過程中有著舉足輕重的作用。目前，利用分子生物學、合成生物學等相關技術已經初步闡明了細胞生長機制，在細胞生長機制的基礎上靈活地調控細胞密度，控制細胞生長速率和產品合成效率，在推動我國生物制造業向規模化、集成化、智能化、綠色化發展方面具有廣闊的應用前景。

圖4 生物制造過程控制

參 考 文 獻

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Regulation and control of microbial growth in bio-manufacturing processes

HOU Hui，LI Chun
（Department of Biological Engineering，School of Life Science，Beijing Institute of Technology，Beijing 100081，China）

Abstract：Improving the yield and production efficiency of bio-based products is the goal of bio-manufacturing and bio-industry. Because of the advantages of fast growth，simple nutritional requirement and convenient gene manipulation，microorganisms are often used as chassis of bio-based products. Thus，the growth regulation and control of microbial cells are particularly important in the process of bio-manufacturing，as the microbial cell growth will directly or indirectly affect the synthesis efficiency of bio-based products. The growth of microorganisms can be affected not only by external conditions such as temperature，dissolved oxygen and pH，but also by their own cell growth mechanism. The cell growth mechanism can be referred to cell division regulation，essential genes expression regulation and programmed cell death. This paper reviewed the molecular regulation of microbial cell growth and division through molecular biology，synthetic biology and systematic biology methods to improve the biological reaction rate and the yield of target products，which provides new insights for the development of efficient bio-manufacturing process in chemical engineering，food industry，bio-pharmaceuticals，environmental protection and other fields.

Key words：bio-manufacturing；cell growth；cell division regulation；essential genes；programmed cell death；bio-industry

中圖分類號：Q 81

文獻標志碼：A

文章編號：1000–6613（2016）06–1837–08

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.06.025

收稿日期：2015-11-26；修改稿日期：2015-12-15。

基金項目：國家杰出青年科學基金項目（21425624）。