HMGB1/Bcl-2表達與結(jié)直腸癌患者化療耐藥及預(yù)后關(guān)系的研究

譚志軍 劉玉瑩 李昌生 楊彩云

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HMGB1/Bcl-2表達與結(jié)直腸癌患者化療耐藥及預(yù)后關(guān)系的研究

譚志軍 劉玉瑩 李昌生 楊彩云

【摘要】目的 研究腫瘤組織內(nèi)高遷移率蛋白族1（High mobility group box 1，HMGB1）和Bcl-2表達與結(jié)直腸癌（CRC）化療耐藥及預(yù)后的關(guān)系。方法 采用免疫組化法分析97名CRC患者腫瘤組織中HMGB1和Bcl-2的表達強度，并分析其與CRC不同臨床病理特征、患者總生存期及化療反應(yīng)率間的關(guān)系。結(jié)果 中分化、低分化CRC中HMGB1高表達率和Bcl-2陽性表達率顯著高正常組織（P＜0.05）。HMGB1表達與CRC患者淋巴浸潤、脈管浸潤及化療反應(yīng)率顯著相關(guān)（P＜0.05），與其他臨床病理特征及患者總生存期無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。Bcl-2表達與患者臨床病理特征及總生存期無顯著相關(guān)性（P＞0.05），但與化療反應(yīng)率顯著相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論 HMGB1高表達和Bcl-2陽性表達可用于預(yù)示CRC化療耐藥，HMGB1高表達可作為CRC預(yù)后的預(yù)測指標。

【關(guān)鍵詞】結(jié)直腸腫瘤； 治療； 耐藥； 預(yù)后

作者單位：262700，壽光市人民醫(yī)院普外科

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，位居惡性腫瘤發(fā)病率第二位［1-2］，40～50歲年齡組人群發(fā)病率最高，男女發(fā)病率之比約為2：1～3：1。文獻報道［3］，近年我國CRC死亡率呈顯著升高趨勢，死亡率年均升高4.71%。

高遷移率蛋白族1（high mobility group box 1，HMGB1）是一種非組蛋白染色體結(jié)合蛋白。其在細胞內(nèi)參與諸多重要生理過程，如轉(zhuǎn)錄、基因修復(fù)等，在細胞外則參與炎癥介導(dǎo)、細胞分化、遷移和腫瘤增殖等生理病理過程［4-8］。研究表明，HMGB1表達升高與多種腫瘤的增殖活性升高及腫瘤遷移存在關(guān)聯(lián)性，如乳腺癌、肝細胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺癌及CRC等［9］。但文獻報道，HMGB1在腫瘤發(fā)病及進展中具有完全相反的雙重作用，既可通過與TLR-4的相互作用，降低樹突細胞對腫瘤抗原的呈遞，導(dǎo)致腫瘤逃逸［10］；也可活化內(nèi)源性TLR-2，促進腫瘤消退［11］。因此，HMGB1在腫瘤發(fā)病、進展中的作用及其對腫瘤放化療效果的影響目前尚不清楚。

Bcl-2蛋白是Bcl-2家族蛋白的主要成員之一，可通過抑制Bax活性發(fā)揮抗凋亡作用。部分研究顯示，Bax表達缺失或降低與腫瘤化療耐藥相關(guān)且是腫瘤預(yù)后的獨立影響因素［12］，提示Bcl-2蛋白過表達可能導(dǎo)致腫瘤化療耐藥和預(yù)后較差。但部分研究顯示，Bcl-2蛋白表達上調(diào)可導(dǎo)致腫瘤患者生存期延長。因此，Bcl-2蛋白在CRC發(fā)病、進展中的作用及其對腫瘤放化療效果的影響，迄今為止亦未完全闡明［13］。

鑒于此，本文對CRC患者腫瘤組織中HMGB1和Bcl-2兩種指標的表達及其與化療耐藥和腫瘤預(yù)后的相關(guān)性進行了臨床實證研究，以期為臨床治療方案的制定提供科學(xué)依據(jù)。

資料與方法

一、研究對象

收集壽光市人民醫(yī)院2004～2010年有完整病理資料的CRC患者腫瘤組織標本97例，正常組織標本（距離腫瘤組織＞5 cm 的正常組織）6例。患者年齡為26～72歲，平均年齡為43.9±12.6歲。其中，高分化CRC共18例、中分化CRC共38例，低分化CRC共41例。所有患者術(shù)前均未接受放、化療，術(shù)后給予3個療程以上以5-氟尿嘧啶（5-FU）/亞葉酸鈣為基礎(chǔ)的聯(lián)合治療方案。

二、病理切片制備及免疫組化分析

患者腫瘤組織以福爾馬林固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，修蠟，連續(xù)切片（4 μm），二甲苯脫蠟，PBS沖洗，在PBS中熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)，0.3%過氧化氫甲醇溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，再次用PBS沖洗，然后在5%牛血清白蛋白（Sigma公司）中孵育30 min阻斷非特異性抗體結(jié)合。以HMGB1單抗（Sigma 公司，稀釋比例為1：300）或鼠抗人Bcl-2單抗（Sigma公司，稀釋比例為1：200）作為一抗4℃下孵育過夜，PBS沖洗后采用生物素化二抗孵育。DAB顯色，蘇木紫復(fù)染，脫水，透明，OLYMPUS BX-41顯微鏡觀察。陰性對照一抗為PBS，陽性對照為已知CRC陽性切片。

三、結(jié)果判定

由兩位病理醫(yī)師雙盲閱片。HMGB1主要在細胞核表達，在胞漿存在弱表達；Bcl-2主要在胞漿表達，二者陽性表達呈淡黃色至棕黃色細顆粒。

光學(xué)顯微鏡下對病理切片進行觀察，按照如下標準進行評價：1.病理圖片中腫瘤細胞核HMGB1免疫組化染色呈彌漫性，視為HMGB1高表達；免疫組化染色呈局灶性，則視為HMGB1低表達。2.Bcl-2表達按照陽性細胞占腫瘤細胞總數(shù)的比例劃分為：0分：無陽性細胞；1分：1%～24%；2分：25%～50%；3分：＞50%。

四、化療反應(yīng)評定

患者完成3療程化療后進行化療反應(yīng)評定，化療結(jié)束后至少隨訪5年。療效評價由盆腔CT檢查、B超檢查、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）測定和B超結(jié)果進行判斷。檢查頻率為每4～6月一次。參考WHO標準［10］分級如下：1. 臨床完全緩解（complete remission，CR）：臨床癥狀消失，盆腔檢查及B超檢查均無包塊，CEA值下降至正常；2. 臨床部分緩解（partial remission，PR）：臨床癥狀消失，病灶縮小＞50%，無疾病進展表現(xiàn)，CEA值較術(shù)前明顯下降但未達正常；3. 臨床無效（no remission，NR）：臨床癥狀存在，病灶縮小＜50%，盆腔檢查及B超檢查有包塊，病灶增大或復(fù)發(fā)，CEA值未下降或下降后再升高、病情在3個月內(nèi)急劇加重，視為臨床無效。五年內(nèi)CR和PR均視為臨床有效，NR為臨床無效。

五、統(tǒng)計學(xué)分析

試驗結(jié)果采用SPSS17.0進行分析。HMGB1、Bcl-2表達與主要臨床預(yù)后指標的比較采用卡方檢驗進行分析；生存期分析采用Kaplan-Meier法；化療反應(yīng)率差別及相關(guān)分析采用Fisher精確檢驗進行分析。P＜0.05視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01視為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、HMGB1、Bcl-2在CRC患者腫瘤組織的表達

CRC腫瘤組織及正常組織標本HMGB1、Bcl-2的表達評分及各組患者的HMGB1、Bcl-2表達陽性率見表1。HMGB1在高分化、中分化、低分化CRC腫瘤組織及正常組織中的高表達率分別為27.8%、55.3%、65.9%和25.0%。其中，中分化、低分化CRC腫瘤組織與高分化CRC及正常組織HMGB1高表達率相比均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

Bcl-2在高分化、中分化、低分化CRC腫瘤組織及正常組織中的高表達率分別為38.9%、47.4%、78.0%和12.5%。其中，中分化、高分化CRC腫瘤組織Bcl-2表達陽性率顯著高于正常組織（P＜0.05）；低分化CRC腫瘤組織Bcl-2表達陽性率高于中分化CRC腫瘤組織（P＜0.05），顯著高于高分化CRC及正常組織（P＜0.01）。

表1 CRC患者腫瘤組織及正常組織中HMGB1、Bcl-2的表達表

腫瘤組織中HMGB1、Bcl-2表達的典型免疫組化病理圖片見圖1。圖1a中CRC腫瘤組織細胞核染色呈典型彌漫性棕黃色，屬于HMGB1高表達；圖1b中CRC腫瘤組織胞漿中呈現(xiàn)大面積棕黃色，屬于Bcl-2高表達。

二、HMGB1、Bcl-2表達與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系

化療結(jié)束后對患者進行了為期5年的隨訪，隨訪至患者死亡或2015年12月。采用單因素分析分別比較了HMGB1、Bcl-2的表達與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果見表2。CRC患者腫瘤組織HMGB1高表達與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤顯著相關(guān)（P＜0.05），與其他臨床病理特征無關(guān)。而CRC患者腫瘤組織Bcl-2表達與CRC患者臨床病理特征均無顯著相關(guān)性。

圖1 CRC患者腫瘤組織中HMGB1、Bcl-2的表達

表2 HMGB1、Bcl-2表達與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系表

三、HMGB1、Bcl-2表達與CRC患者生存期的關(guān)系

采用使用Kaplan-Meie法繪制HMGB1高、低表達及Bcl-2陰性和陽性表達的生存曲線，并采用對數(shù)秩檢驗分析差異的顯著性。結(jié)果見圖2。HMGB1高表達及Bcl-2陽性表達對CRC患者生存期均無顯著影響（P＞0.05）。

四、HMGB1、Bcl-2表達與CRC患者化療反應(yīng)率的關(guān)系

97名患者中，HMGB1高表達者63名，對化療有效29名，化療反應(yīng)率46%；HMGB1低表達者為34名，對化療有效23名，化療反應(yīng)率67.6%；兩組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.03）。Bcl-2≥1者71名，對化療有效35名，化療反應(yīng)率49.36；Bcl-2＜1者為26名，對化療有效17名，化療反應(yīng)率65.4%；兩組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.04），見表3。

討 論

本研究測定了CRC患者腫瘤組織HMGB1、Bcl-2表達與CRC臨床病理特征及化療反應(yīng)率之間的關(guān)系。國內(nèi)外對影響CRC預(yù)后的各種因素已進行了大量研究，包括多因素研究和單因素研究等，在患者年齡、TNM分期、Dukes分期、瘤徑、淋巴浸潤、脈管浸潤、神經(jīng)侵犯和遠處轉(zhuǎn)移等多個指標中，淋巴浸潤、脈管浸潤和遠處轉(zhuǎn)移均為CRC的獨立預(yù)后因素［13］。

HMGB1既是一種細胞核內(nèi)細胞因子，也是一種損傷細胞釋放的損傷相關(guān)分子模式分子（damage-associated molecular pattern molecule，DAMP）［14］。最近研究報道，HMGB1在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，包括血管生成、細胞凋亡及組織浸潤和轉(zhuǎn)移等［15-16］。在本實驗中，我們研究了CRC患者腫瘤細胞核中HMGB1染色（彌漫性染色和局灶性染色）與腫瘤預(yù)后和化療耐藥的關(guān)系。結(jié)果表明，HMGB1高表達（彌漫性染色）與CRC淋巴轉(zhuǎn)移和脈管浸潤顯著相關(guān)（P＜0.05），且HMGB1高表達的CRC化療反應(yīng)率顯著低于HMGB1低表達的CRC，說明HMGB1高表達時，CRC惡性程度高并易產(chǎn)生化療耐藥。國外研究報道，HMGB1可通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子C和D，促進淋巴管生成［17］。此外，據(jù)報道，在鼻咽癌中，HMGB1表達也與腫瘤細胞侵襲相關(guān)［15］。關(guān)于HMGB1誘導(dǎo)腫瘤細胞化療耐藥的具體機制目前尚不清楚。由于大部分抗腫瘤藥物的作用機制與誘導(dǎo)腫瘤細胞自噬或凋亡有關(guān)，而HMGB1是調(diào)節(jié)細胞自噬的關(guān)鍵因子之一，因此，目前研究認為HMGB1通過調(diào)節(jié)細胞自噬導(dǎo)致腫瘤化療耐藥［18］。在本實驗中，未發(fā)現(xiàn)HMGB1高表達對CRC患者生存期的顯著影響。鑒于HMGB1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的雙重作用［10-11］，兩種相反作用的消長可能是導(dǎo)致HMGB1高表達對CRC生存期無顯著影響的原因。

Bcl-2屬于抑制細胞凋亡的蛋白。本實驗中發(fā)現(xiàn)，CRC患者腫瘤細胞中Bcl-2表達為陽性時，其對化療的反應(yīng)率顯著低于Bcl-2陰性表達的CRC患者，提示Bcl-2過表達可能導(dǎo)致腫瘤化療耐藥，其誘導(dǎo)耐藥的機制可能與其對腫瘤細胞凋亡的抑制作用有關(guān)。國內(nèi)外已對Bcl-2與CRC患者預(yù)后的影響進行了大量研究，但研究結(jié)果差異較大。大部分研究結(jié)果認為，Bcl-2與CRC患者主要臨床病理指標無顯著相關(guān)性［19］。本實驗發(fā)現(xiàn)Bcl-2與CRC預(yù)后間不存在顯著相關(guān)性。由于Bcl-2家族蛋白中存在Bax和Bcl-2等促凋亡和抑凋亡因子，兩類因子間存在相互作用［12-13］，因此，Bax/Bcl-2兩類因子的比值可能更適于作為CRC預(yù)后的生物標志［20］。

圖2 CRC患者腫瘤組織中HMGB1、Bcl-2表達對總生存期的影響

表3 HMGB1、Bcl-2表達與CRC患者化療反應(yīng)率的關(guān)系表

參 考 文 獻

[ 1 ] Haggar FA, Boushey RP. Colorectal cancer epidemiology: incidence, mortality, survival, and risk factors. Clin Colon Rectal Surg, 2009, 22(4): 191-197.

[ 2 ] Ward S, Hepburn E, Li K, et al. Selective recruitment and retainment of regulatory T cells in human colorectal cancer. The Lancet, 2013, 381: S113.

[ 3 ] 萬德森. 結(jié)直腸癌流行病學(xué)與預(yù)防. 中國中西結(jié)合外科雜志, 2011, 17(1): 3-6.

[ 4 ] Lotze MT, Tracey KJ. High-mobility group box 1 protein (HMGB1): nuclear weapon in the immune arsenal. Nat Rev Immunol, 2005, 5(4):331-342.

[ 5 ] Muller S, Scaffidi P, Degryse B, et al. New EMBO members′review: the double life of HMGB1 chromatin protein: architectural factor and extracellular signal. EMBO J, 2001, 20(16): 4337-4340.

[ 6 ] Dong Xda E, Ito N, Lotze MT, et al. High mobility group box I (HMGB1) release from tumor cells after treatment: implications for development of targeted chemoimmunotherapy. J Immunother, 2007,30(6): 596-606.

[ 7 ] Ellerman JE, Brown CK, de Vera M, et al. Masquerader: high mobility group box-1 and cancer. Clin Cancer Res, 2007, 13(10): 2836-2848.

[ 8 ] Tang D, Kang R, Zeh HJ, et al. High-mobility group box 1 and cancer. Biochim Biophys Acta, 2010, 1799(1-2): 131-140.

[ 9 ] Moriwaka Y, Luo Y, Ohmori H, et al. HMGB1 attenuates anti-metastatic defense of the lymph nodes in colorectal cancer.Pathobiology, 2010, 77(1):17-23.

[ 10 ] Apetoh L, Ghiringhelli F, Tesniere A, et al. Toll-like receptor 4-dependent contribution of the immune system to anticancer chemotherapy and radiotherapy. Nat Med, 2007, 13(9): 1050-1059.

[ 11 ] Curtin JF, Liu N, Candolfi M, et al. HMGB1 mediates endogenous TLR2 activation and brain tumor regression. PLoS Med, 2009, 6(1): e10.

[ 12 ] Zeestraten EC, Benard A, Reimers MS, et al. The prognostic Value of the Apoptosis pathway in colorectal Cancer: A Review of the Literature on Biomarkers Identified by Immunohistochemistry. Biomarkers in cancer, 2013, 5: 13-29.

[ 13 ] 易呈浩, 葛維挺, 黃彥欽, 等. 1368例結(jié)直腸癌TNM分期及預(yù)后分析.中國腫瘤臨床, 2012, 39(9): 597-601.

[ 14 ] Bianchi ME. DAMPs, PAMPs and alarmins: all we need to know about danger. J Leukoc Biol, 2007, 81(1): 1-5.

[ 15 ] Mantovani A. Cancer: inflaming metastasis. Nature, 2009, 457(7225): 36-37.

[ 16 ] Mantovani A, Allavena P, Sica A, et al. Cancer-related inflammation. Nature, 2008, 454(7203): 436-444.

[ 17 ] Moriwaka Y, Luo Y, Ohmori H, et al. HMGB1 attenuates anti-metastatic defense of the lymph nodes in colorectal cancer. Pathobiology, 2010, 77(1): 17-23.

[ 18 ] 何賢輝, 歐陽東云. 細胞自噬與高遷移率族蛋白B-1 (HMGB1)介導(dǎo)腫瘤耐藥的研究進展. 暨南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2011, 32(2): 126-140.

[ 19 ] Scopa CD, Vagianos C, Kardamakis D, et al. bcl-2/bax ratio as a predictive marker for therapeutic response to radiotherapy in patients with rectal cancer. Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2001, 9(4): 329-334.

[ 20 ] hodapasand E, Jafarzadeh N, Farrokhi F, et al. Is Bax/Bcl-2 ratio considered as a prognostic marker with age and tumor location in colorectal cancer? Iran Biomed J, 2015, 19(2): 69-75.

（本文編輯：楊明）

譚志軍, 劉玉瑩, 李昌生, 等. HMGB1/Bcl-2表達與結(jié)直腸癌患者化療耐藥及預(yù)后關(guān)系的研究[J/CD]. 中華結(jié)直腸疾病電子雜志, 2016, 5(2): 153-158.

?論著?

Impact of HMGB1 expression and Bcl-2 expression on chemoresistance and prognosis in colorectal cancer

Tan Zhijun, Liu Yuying, Li Changsheng, Yang Caiyun. Department of General Surgery, the Shouguang People Hospital, Shouguang 262700, China Corresponding author: Tan Zhijun, Email: 13963668120@163.com

【Abstract】Objective To investigate the impact of HMGB1 expression and Bcl-2 expression on chemo-resistance and prognosis of colorectal cancer (CRC). Method HMGB1 expression and Bcl-2 expression in CRC tumor tissues from 97 patients was analyzed by immunohistochemistry. Relationship among HMGB1 high expression, Bcl-2 positive expression, clinical histological features, overall survival and chemotherapy response rate were compared. Results HMGB1 high expression rates and Bcl-2 positive expression rates in low differentiated and differentiation CRC specimens were significant higher than that in high differentiated tissues (P＜0.05). Lymphatic invasion, venous invasion and chemotherapy response rate showed significant correlation with HMGB1 expression (P＜0.05). Chemotherapy response rate was also significantly affected by Bcl-2 expression (P＜0.05). Conclusions HMGB1 high expression and Bcl-2 positive expression may be used to predict chemo-resistance. HMGB1 high expression may be used as predictors of CRC prognosis.

【Key words】Colorectal neoplasms; Therapy; Drug resistance; Prognosis

DOI：10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2016.02.08

通信作者：譚志軍，Email：13963668120@163.com

收稿日期：（2016-2-8）