體液檢測在結直腸癌中應用的研究進展

邢寶才 劉偉

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體液檢測在結直腸癌中應用的研究進展

邢寶才 劉偉

邢寶才 教授、主任醫師、博士生導師。北京大學腫瘤醫院肝膽外一科主任，外科教研室主任。從事腫瘤外科的臨床與研究近三十年，主要的研究領域是結直腸癌肝轉移，原發性肝癌的外科治療。對結直腸癌肝轉移的外科手術與圍手術期的治療有較高的造詣。目前擔任著中華外科學會肝臟外科學組委員、中國抗癌協會肝癌專業委員會常委、中國抗癌協會大腸癌委員會肝轉移學組委員、中國醫師協會外科分會MDT專委會副主任委員、中國醫師協會外科分會肝臟外科委員會常委、中國醫促會肝臟外科分會副主任委員、中國醫促會結直腸癌肝轉移分會常委。擔任《中華肝膽外科雜志》等多個雜志的編委。

【摘要】體液檢測是指以血液為主的體液標本中細胞及核酸的檢測，包括了循環腫瘤細胞和循環腫瘤DNA 兩大類。能幫助實時動態監測腫瘤原發灶及轉移復發灶基因組信息，協助早期診斷、療效監測、預后判斷，也有助于靶向治療適應癥的評估，從而推進精準醫療的實施。液態活檢屬于新型的無創性分子病理檢測方式。在結直腸癌診療領域具有廣闊的臨床應用前景，也是推動腫瘤基礎研究進展的重要助力。

【關鍵詞】結直腸腫瘤； 治療應用； 體液檢測； 循環腫瘤細胞，循環腫瘤DNA

作者單位：100142 北京大學腫瘤醫院暨北京市腫瘤防治研究所肝膽胰外一科， 惡性腫瘤發病機制及轉化研究教育部重點實驗室

結直腸癌在我國發病率居所有惡性腫瘤中第五位。2015年我國新發病例376300，死亡率191，000［1］。其中，50%結直腸癌患者會發生肝轉移［2-3］。通過多學科治療，結直腸癌肝轉移5年生存率和10年生存率可達到50%和20%［4-5］。然而，目前現有的腫瘤標志物在預測復發和轉移方面并不盡如人意，其存在滯后性且靈敏度和特異度都較低。因此，結直腸癌研究的一個重要目標就是找到可以方便準確預測復發和轉移的生物標記物。隨著對結直腸癌肝轉移的深入研究，對于手術后切除預后預測，療效評估及復發監測，體液檢測在結直腸癌肝轉移中逐漸進入更為廣泛的研究。其主要指血液中包含的兩種可以用于分析腫瘤分子表型的物質，即循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTC）和循環腫瘤DNA（circulating tumor，ctDNA）。

循環腫瘤細胞是指能在腫瘤患者外周血中檢測到、來源于實體腫瘤、逃離宿主免疫殺傷后存活的異質性腫瘤細胞［6］。進入血液循環而未被清除的腫瘤細胞通過遷移、黏附、相互聚集形成微小癌栓，并在一定條件下發展為轉移灶［7］。CTC以單個細胞或細胞團（又稱循環腫瘤微栓子，CTM）存在于循環系統中。研究發現CTC的形成與上皮細胞-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）機制有關［8］。血液中的CTC 既可能是直接從病灶脫落進入血液中的上皮特征CTC，也可能是經歷EMT由原發灶或轉移灶脫落進入并生存于血液循環中的CTC。最新研究發現，CTM與間質細胞表型CTC密切相關，并且高比例的間質細胞表型CTC與化學治療耐藥有關［9］。

循環腫瘤DNA是一類源于腫瘤細胞的雙鏈DNA片段，大小在0.18～21 kb之間，主要存在于血液、滑膜液和腦脊液等液體中，可經尿液和糞便排出，含量極微。ctDNA的發現可追溯至對循環游離DNA（cell-free circulatingDNA，cfDNA）的早期研究中。cfDNA是由機體細胞釋放入外周血循環后發生部分降解的內源性DNA。1977年Leon等發現腫瘤患者外周血中cfDNA濃度較正常人顯著升高，且具有腫瘤細胞的基因組特征［10-11］。通過對cfDNA中腫瘤特異性的畸變（如腫瘤原癌基因和致癌基因突變、微衛星改變和DNA甲基化等）的識別，證實其為腫瘤細胞來源的cfDNA，即ctDNA，且與腫瘤細胞基因組信息相一致［11］。ctDNA主要來源于：1.壞死的腫瘤細胞；2.凋亡的腫瘤細胞；3.腫瘤細胞的外排體。

一、常用檢測技術

（一）CTCs分離、富集相關技術

1.免疫磁珠富集法（immunomagnetic beadsseparation，IMS）

IMS技術基于細胞表面的抗原與連有特異性抗體的磁珠相結合，并在外源磁場的作用下富集細胞，其根據分離的策略可以分為陽性富集法和陰性富集法兩大類。陽性富集法是指磁珠結合得到的細胞就是所需要的細胞。目前唯一已獲得美國食品藥品監督局批準上市的循環腫瘤細胞檢測試劑盒就是針對細胞表面的上皮細胞粘附分子來分離CTCs。根據CTCs的含量與臨床預后的關聯其他還在研究階段的磁珠包被標記物如廣譜標記物（全角蛋白）和其他腫瘤類型相關標記物如CerBb2、Mucin、AFP等。此外，用于分離CTCs的標記物除了蛋白質類標記物，還包括了mRNA 和端粒酶類的標記物，提高了CTCs的檢出效率［12］。陰性富集法是指磁珠結合得到的細胞不是所需要的細胞，主要應用了針對白細胞的廣譜標記物CD45，在磁場作用中剔除了有核細胞游中的白細胞，其中未被結合的細胞就是所需要的CTCs，能大大增加CTCs 的檢出數量［13］。

2.CTCs芯片技術

第一代CTCs芯片是基于微流體學原理，以微陣距的方式將針對CTCs細胞表面標記物（EpCAM）的抗體包被在芯片上，當血液樣本通過芯片時，就能通過抗體將其中的CTCs細胞捕獲下來。第二代芯片根據微流體渦流原理設計了彎道型的內槽，增加了細胞與包被抗體時間的接觸時間，顯著提高了CTCs的獲取效率［14］。可以在芯片上還能進行各種原位檢測，如蘇木素-伊紅染色、免疫熒光染色等，透過芯片通過顯微鏡能直觀地觀察CTCs的形態學特征和染色結果。

3.濾過膜分離法（filter membrane filtration，FMF）

FMF技術基于CTCs 的細胞體積顯著大于白細胞的原理，采用一定孔徑的濾過膜將CTCs從血液中分離出來，也被稱為膜濾過分離腫瘤細胞技術（isolation by size of epithelial tumor cells，ISET），每毫升血液中可以提取到至少1個腫瘤細胞［15］。由于ISET法分離CTCs主要基于細胞的體積而不是細胞表面的相關抗原，因此主要適用于異質性明顯的惡性腫瘤如肺癌、胃癌和前列腺癌等，大大降低了由于抗原交叉表達或差異表達而導致的假陽性率［16］。

（二）ctDNA分離及檢測技術

ctDNA由于片段較小、含量很少，而且容易和血漿蛋白相結合，因而常規的提取效率都不高。針對血漿中ctDNA的抽提原理主要有四大類：鹽析法、酚-氯仿抽提法、微柱吸附法和磁珠吸附法。而傳統的鹽析法和酚-氯仿法由于操作步驟復雜、需要使用有機溶劑、ctDNA的提取效率較低。通過比較各類試劑盒發現，磁珠法獲得的ctDNA在質量和含量上都要優于微柱吸附法，假陽性率也較低。ctDNA檢測技術根據檢測目的來選擇相應的技術方法，其中大部分是以PCR技術為基礎，如實時熒光定量PCR、甲基化特異性PCR等，也有基于微珠富集原理的方法［17］。目前，ctDNA檢測技術已經廣泛地應用于K-ras、BRAF、HER-2、p53、EGFR、APC等腫瘤靶向治療、診斷及預后相關標記的檢測。

二、臨床應用

（一）判斷預后

CTC可以預測患者預后。一項薈萃研究發現，當CTC＞3個/7.5 mL，則結直腸癌的5年生存率較低，治療效果也較差；但如果治療后CTC水平可下降（＜3個/7.5 mL），則預后較好［18］。該研究表明，CTC數量的多少與結直腸癌患者遠處轉移以及預后關系密切，可用于判斷結直腸癌患者預后。同時，Cohen等人發現，CTC≥2個是結直腸癌肝轉移患者的不良預后因素（HR：2.78，95%CI：1.10～7.02），并且與圍手術期死亡率相關。結直腸癌肝轉移患者CTC平均數目普遍多于無轉移的患者，而且可切除的結直腸癌肝轉移患者CTC陽性率遠低于不可切除患者［19］。

（二）療效評估

隨著腫瘤藥物多樣化的出現，如何選擇安全可靠的療效評估手段以驗證新的治療方法的有效性，是腫瘤治療過程中所面臨的重要挑戰。目前臨床常用的療效監測方法，包括血清學指標和影像學檢查均存在諸多不足。體液檢測能否成為療效評估的手段，已經引起越來越多的注意。ctDNA作為一種新的生物標志物，可滿足臨床實時、動態、無創監測腫瘤負荷變化的要求。Tie等人發現，術前化療的結直腸癌肝轉移患者，ctDNA水平可以在化療2周期后發生顯著下降；而相應的CT檢查則需要化療開始后的8～10周時才能進行評價。同時，ctDNA水平降低10倍以上時，肝切除術后無病生存時間明顯延長。CTC計數不僅在晚期腫瘤患者的預后評估方面具有意義，其治療前后的數目變化，也可在一定程度上反映療效，可能在療效監測方面具有意義。Nole等研究顯示，治療前CTC超出5個/7.5 mL的轉移性乳腺癌患者，約一半患者的CTC數目可在治療中降低［20］。若CTC數目無變化或增高，則提示治療無效。

（三）復發監測

目前，術后或放療后，體液檢測能否根據分子水平證據判斷復發仍舊存在爭議。患者外周血中已經有腫瘤細胞的存在。雖然，大部分腫瘤細胞被免疫系統吞噬，但是在適當的條件下能進一步發展成新的腫瘤灶。早期研究通過RT-PCR方法，發現未接受相關治療的患者已知的轉錄因子發生活化，是復發的前期表現［21］。觀察結直腸癌患者術后2～5年ctDNA的情況，結果顯示術后檢測到ctDNA的患者病情復發，而陰性的患者沒有復發［22］。因此ctDNA是切除后殘留病灶的潛在標志物。ctDNA應在手術后（在一般情況下，手術后6～8周）輔助治療之前進行檢測，以得到最佳的治療決策。不過，某些情況下cfDNA濃度低于檢出突變的最佳量，所以使用ctDNA 作為診斷癌癥和檢測微小殘留病灶時需要高度特異性的標記物及更靈敏的分析技術。

（四）靶向藥物治療的耐藥性監測

CTCs對晚期腫瘤患者進行預后判斷以及療效監測的意義，都是基于其數目的變化。而CTCs的另一項潛在臨床價值是基于其分子改變確定靶向藥物的耐藥性監測。有文獻報道，可在轉移性結腸癌患者的CTCs中檢測到KRAS基因的突變［23］，并且30%接受靶向藥物治療的患者會發生繼發性KRAS基因突變。提示通過跟蹤檢測外周血中CTCs的分子改變，可以作為靶向藥停用的依據。尤其是針對不易獲得腫瘤組織的晚期轉移性腫瘤患者，在使用靶向藥物治療前，通過檢測腫瘤組織和（或）CTCs的分子改變來選擇靶向藥物；在靶向藥物治療過程中，通過動態監測CTCs的分子改變，來判斷靶向藥物治療的終點。分子改變早于影像學改變，從而提示臨床醫生對治療過程的早期干預、降低不必要的費用、減輕患者遭受的不良反應。

（五）腫瘤負荷

結直腸癌肝轉移患者常規評價腫瘤負荷的方法僅局限于影像學檢查。對于術前化療患者的有效性評價，也僅僅依靠RECIST標準。體液檢測的出現，能夠確切評價肝臟腫瘤負荷。Kaifi通過回顧性分析24例結直腸癌肝轉移患者發現，當CTC≥3個/ 7.5 mL時，腫瘤/肝體積比＞30%；并且CTC數目與血中CEA水平保持高度一致性［24］。

綜上，相較于傳統的組織活檢或固相活檢，體液檢測的優勢十分明顯。由于樣本來源是體液，尤其是血液，臨床獲得樣本途徑非常簡便，可以做到隨時取樣、隨時監測，但是液態活檢有一定的局限性。

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（本文編輯：楊明）

邢寶才,劉偉. 體液檢測在結直腸癌中應用的研究進展[J/CD].中華結直腸疾病電子雜志, 2016, 5(2): 110-113.

?述評?

The advances of the liquid biopsy in colorectal cancer

Xing Baocai, Liu Wei. Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, Key Laboratory of Carcinogenesis and Translational Research, Ministry of Education, Peking University School of Oncology, Beijing Cancer Hospital and Institute, Beijing 100142, China Corresponding author: Xing Baocai, Email: xingbaocai88@sina.com

【Abstract】Liquid biopsy refers to the analyses of circulating tumor cells or circulating tumor DNA that mainly exist in the bloodstream and other body fluid. Liquid biopsy is a novel kind of non-invasive technique and has a wide prospect of clinical application in the molecular pathological field. This review presents the advances of liquid biopsy and its clinical application values in the field of colorectal cancer, including prognosis assessment, early cancer screening and prediction of treatment responses.

【Key words】Colorectal neoplasms; Therapeutic uses; Liquid biopsy; CTC; ctDNA

DOI：10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2016.02.01

基金項目：國家自然科學基金（81371868）

通信作者：邢寶才，Email：xingbaocai88@sina.com

收稿日期：（2016-3-26）