滋腎通關(guān)膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

劉東順 熊筱娟 吳志軍 樸淑娟 陸文銓

摘要：目的 建立滋腎通關(guān)膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用薄層色譜法對(duì)制劑中知母、黃柏進(jìn)行定性鑒別。采用高效液相色譜法同時(shí)對(duì)制劑中新芒果苷、鹽酸黃柏堿、芒果苷、鹽酸小檗堿進(jìn)行定量檢測(cè)。結(jié)果 通過(guò)薄層鑒別分別檢出知母中的芒果苷、黃柏中的鹽酸黃柏堿。新芒果苷、鹽酸黃柏堿、芒果苷、鹽酸小檗堿分別在0.025 25～2.02 ?g（r=0.999 7）、0.025 5～2.04 ?g（r=0.999 7）、0.026～2.08 ?g（r=0.999 7）、0.025 5～2.04 ?g（r=0.999 6）范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系，平均加樣回收率分別為99.99%、101.06%、103.05%、100.55%，RSD分別為2.69%、5.62%、2.49%、2.06%。結(jié)論 本方法準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定、可靠，重復(fù)性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)。

關(guān)鍵詞：滋腎通關(guān)膠囊；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜法；高效液相色譜法；新芒果苷；鹽酸黃柏堿；芒果苷；鹽酸小檗堿

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.07.027

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）07-0104-04

Study on Quality Standard for Zishen Tongguan Capsules LIU Dong-shun1，2， XIONG Xiao-juan2， WU Zhi-jun1， PIAO Shu-juan1， LU Wen-quan1 （1. Changzheng Hospital， Second Military Medical University， Shanghai 200003， China； 2. College of Chemical and Biological Engineering， Yichun University， Yichun 336000， China）

Abstract： Objective To establish a quality standard for Zishen Tongguan Capsules. Methods Anemarrhneae Rhizoma and Phellodendri Chinensis Cortex were qualitatively identified by TLC method. The contents of neomangferin， phellodendrine hydrochloride， mangiferin and berberine hydrochloride in Zishen Tongguan Capsules were quantitatively determined by HPLC method. Results The spots of qualitative identification method were clear without interference. Neomangferin in Anemarrhneae Rhizoma and phellodendrinehy drochloride in Phellodendri Chinensis Cortex were identified. Neomangferin， phellodendrinehy drochloride， mangiferin and berberine hydrochloride showed good linearity in the range of 0.025 25–2.02 ?g （r=0.999 7）， 0.025 5–2.04 ?g （r=0.999 7）， 0.026–2.08 ?g （r=0.999 7）， and 0.025 5–2.04 ?g （r=0.999 6） respectively. The average recoveries of neomangferin， phellodendrinehy drochloride， mangiferin and berberine hydrochloride were 99.99%， 101.06%， 103.05%， and 100.55%， respectively. The RSD were 2.69%， 5.62%， 2.49%， and 2.06%， respectively. Conclusion The method is accurate and rapid， with good stability， reliability and reproducibility， which can be used for the quality control and evaluation of the preparation of Zishen Tongguan Capsules.

Key words： Zishen Tongguan Capsules； quality standard； TLC； HPLC； neomangferin； phellodendrinehy drochloride； mangiferin； berberine hydrochloride

滋腎通關(guān)膠囊由知母、黃柏、肉桂等中藥提取加工而成，處方出自李東垣《蘭室秘藏》，適于“不渴而小便閉，熱在下焦血分也”，具有滋腎清熱、化氣通關(guān)之功，用于治療熱蘊(yùn)膀胱之小腹脹滿(mǎn)、尿閉不通?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)該方在治療前列腺增生、預(yù)防尿路感染、治療肝硬化腹水等方面也有一定療效[1-3]。芒果

基金項(xiàng)目：軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高計(jì)劃（14ZJZ04-1）

通訊作者：陸文銓?zhuān)珽-mail：lwqp@163.com

苷和新芒果苷為知母清熱作用的主要有效成分，具有抗病毒、抗炎、抗氧化、利尿、預(yù)防肥胖、免疫抑制等作用[4-7]；黃柏中的鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿既是其活性成分又是指標(biāo)成分[8]。為更好控制該制劑質(zhì)量，本研究采用TLC對(duì)方中知母、黃柏進(jìn)行定性鑒別，采用HPLC對(duì)方中新芒果苷、鹽酸黃柏堿、芒果苷、鹽酸小檗堿進(jìn)行定量檢測(cè)。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀（Agilent，美國(guó)），包括G1311C輸液泵、G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G4212B-DAD紫外檢測(cè)器、Chemstation色譜工作站；十萬(wàn)分之一天平（Sartorius CPA225D，德國(guó)）；旋渦振蕩混和器WL-901 Vortex（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；超聲儀（SK7200H型，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）。

滋腎通關(guān)膠囊（批號(hào)140429、140430、140431），解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)上海長(zhǎng)征醫(yī)院制劑中心研制；芒果苷對(duì)照品（批號(hào)MB6776），大連美侖生物技術(shù)有限公司；新芒果苷對(duì)照品（批號(hào)15011309），上海士峰生物科技有限公司；鹽酸黃柏堿對(duì)照品（批號(hào)111895-201303）、鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)110713-201212），中國(guó)食品藥品檢定研究院；知母對(duì)照藥材（批號(hào)130801）、黃柏對(duì)照藥材（批號(hào)130901），安徽亳州利鋒藥業(yè)有限公司；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 薄層色譜鑒別

2.1 知母

取3批研細(xì)后的本品內(nèi)容物各1 g，各加90%甲醇50 mL，超聲處理30 min，過(guò)濾，濾液濃縮至干，殘?jiān)?0%甲醇5 mL溶解，作為供試品溶液。另取知母對(duì)照藥材1 g，加90%甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液濃縮至干，殘?jiān)?0%甲醇5 mL溶解，作為對(duì)照藥材溶液。另取缺知母的陰性樣品，同法制得陰性對(duì)照溶液。另取芒果苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）附錄Ⅵ B][9]試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液各4 ?L，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二甲苯-乙酸乙酯-甲酸（1∶7∶2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視[10-11]。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品在相應(yīng)位置上無(wú)干擾。

2.2 黃柏

取3批研細(xì)后的本品內(nèi)容物各1 g，各加90%甲醇50 mL，超聲處理30 min，過(guò)濾，濾液濃縮至干，殘?jiān)?0%甲醇5 mL溶解，作為供試品溶液。另取黃柏對(duì)照藥材1 g，加90%甲醇50 mL，超聲處理30 min，過(guò)濾，濾液濃縮至干，殘?jiān)?0%甲醇5 mL溶解，作為對(duì)照藥材溶液。另取缺黃柏的陰性樣品，同法制得陰性對(duì)照溶液。另取鹽酸黃柏堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）附錄Ⅵ B][9]試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液各4 ?L，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-水-甲酸（4∶5∶1）的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液[12-13]。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品在相應(yīng)位置上無(wú)干擾。

3 芒果苷含量測(cè)定

3.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m，柱號(hào)201054653）；流動(dòng)相：乙腈?0.1%磷酸（1000 mL加50 ?L二乙胺），梯度洗脫（0～10 min，2%～11%乙腈；10～21 min，11%乙腈；21～22 min，11%～9%乙腈；22～30 min，9%乙腈；30～34 min，9%～24%乙腈；34～50 min，24%乙腈；50～60 min，24%～60%乙腈），2次進(jìn)樣之間用初始流動(dòng)相平衡10 min；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 ?L。

3.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱(chēng)取新芒果苷對(duì)照品2.02 mg、鹽酸黃柏堿對(duì)照品2.04 mg、芒果苷對(duì)照品2.08 mg、鹽酸小檗堿對(duì)照品2.04 mg，分別置于1 mL棕色容量瓶中，加入甲醇適量，超聲處理30 min使溶解，放至室溫，定容，制得對(duì)照品溶液。精密量取各對(duì)照品溶液適量，加初始流動(dòng)相混勻定量稀釋成每1 mL含新芒果苷、鹽酸黃柏堿、芒果苷、鹽酸小檗堿分別為404、408、416、408 ?g的混合對(duì)照品貯備液，經(jīng)0.45 ?m微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，備用。

3.3 供試品溶液的制備

取滋腎通關(guān)膠囊內(nèi)容物約1.0 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入90%甲醇50 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（功率200 W，頻率53 Hz）30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用90%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

3.4 陰性對(duì)照品的制備

取除知母、黃柏外的其他藥材，按“3.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

3.5 空白試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液，按上述方法進(jìn)樣，結(jié)果陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

3.6 線(xiàn)性關(guān)系考察

將混合對(duì)照品儲(chǔ)備液用初始流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成相當(dāng)于1/2、1/8、1/10、1/20、1/80、1/160濃度混合對(duì)照品貯備液的系列溶液，分別吸取10 ?L注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測(cè)定，記錄色譜圖，以峰面積對(duì)濃度（?g/mL）進(jìn)行線(xiàn)性回歸計(jì)算，得線(xiàn)性回歸方程。各對(duì)照品濃度與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.7 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣10 ?L，重復(fù)進(jìn)樣6次，在上述色譜條件下測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果新芒果苷、鹽酸黃柏堿、芒果苷、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為0.55%、0.55%、0.43%、0.45%，表明儀器精密度良好。

3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（批號(hào)140429），分別于0、2、4、8、12、24 h分別樣測(cè)定峰面積，結(jié)果新芒果苷、鹽酸黃柏堿、芒果苷、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為3.83%、2.45%、2.65%、2.34%，說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批滋腎通關(guān)膠囊（批號(hào)140429），精密稱(chēng)取6份，按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定，結(jié)果新芒果苷、鹽酸黃柏堿、芒果苷、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為1.43%、1.11%、0.78%、0.62%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.10 加樣回收率試驗(yàn)

分別精密稱(chēng)取6份已測(cè)定含量的樣品，置于具塞錐形瓶中，精密加入一定量的混合對(duì)照品，按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 ?L，記錄峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

3.11 樣品含量測(cè)定

取樣品3批，按“3.3”項(xiàng)下方法每批制備3份供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，分別代入回歸方程，計(jì)算樣品中各成分含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

4 討論

中藥成方制劑通常由多味藥組成，其藥效是多種活性物質(zhì)綜合發(fā)揮作用的結(jié)果，若只對(duì)單味藥或單一成分進(jìn)行檢測(cè)，難以全面控制制劑的內(nèi)在質(zhì)量。本試驗(yàn)采用TLC對(duì)處方中的知母、黃柏進(jìn)行定性鑒別，采用HPLC同時(shí)測(cè)定滋腎通關(guān)膠囊中新芒果苷、鹽酸黃柏堿、芒果苷、鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果穩(wěn)定可靠，方法簡(jiǎn)便可行，能夠有效控制該制劑的質(zhì)量。

試驗(yàn)比較了超聲提取和回流提取2種方法制備供試品溶液，所測(cè)各成分含量無(wú)明顯差異，因超聲法具有操作簡(jiǎn)便、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)，故選用超聲提取法；篩選提取溶劑時(shí)考察了甲醇、90%甲醇、75%甲醇，結(jié)果90%甲醇提取效果較好；考察了超聲提取30、40、50 min的提取效果，結(jié)果相當(dāng)[14]。故確定90%甲醇為提取溶劑，超聲提取時(shí)間為30 min。

通過(guò)DAD檢測(cè)器對(duì)供試品色譜200～400 nm進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果顯示新芒果苷、鹽酸黃柏堿、芒果苷、鹽酸小檗堿最大吸收波長(zhǎng)分別為258、284、258、265 nm。由于滋腎通關(guān)膠囊中新芒果苷、鹽酸黃柏堿含量較低，為了兼顧新芒果苷、鹽酸黃柏堿的檢測(cè)準(zhǔn)確度，故選擇265 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，在此波長(zhǎng)處4個(gè)成分均可得到滿(mǎn)意的靈敏度。

流動(dòng)相考察中，選擇了乙腈-乙酸[15-16]、乙腈-磷酸鹽[17]、甲醇-磷酸[18]系統(tǒng)進(jìn)行比較。結(jié)果表明采用乙腈-磷酸鹽系統(tǒng)能達(dá)到完全分離并且峰形較好，故選擇乙腈-磷酸鹽系統(tǒng)作為流動(dòng)相。

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（收稿日期：2015-08-14）

（修回日期：2015-08-23；編輯：陳靜）