大承氣湯對過敏性哮喘小鼠肺組織形態(tài)及IgE水平的影響

鐘大玲 吳佳佳 李根茂 葛東宇 吳珺 彭桂英

摘要：目的 觀察大承氣湯對過敏性哮喘小鼠肺組織形態(tài)學變化、肺指數、脾指數以及總IgE水平的影響，探討其相關作用機制。方法 采用卵白蛋白致敏加激發(fā)的方式建立小鼠過敏性哮喘模型。將20只雌性C57BL/6小鼠隨機分為正常組、模型組、大承氣湯組和陽性藥組，各給藥組給予相應藥物灌胃。測定各組小鼠肺指數、脾指數，ELISA測定血清IgE含量，HE染色進行病理觀察。結果 與正常組比較，模型組小鼠肺指數增加，血清IgE含量明顯升高（P<0.01），肺組織出現炎性病理改變；與模型組比較，大承氣湯組和陽性藥組小鼠肺指數明顯降低（P<0.05），血清IgE含量明顯降低（P<0.01），肺組織形態(tài)結構明顯改善。結論 大承氣湯對哮喘小鼠肺部炎癥有抑制作用。

關鍵詞：過敏性哮喘；肺腸同治；大承氣湯；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.07.015

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）07-0058-03

Effects of Dachengqi Decoction on Pulmonary Histology and Total IgE Levels in Mice with Allergic Asthma ZHONG Da-ling， WU Jia-jia， LI Gen-mao， GE Dong-yu， WU Jun， PENG Gui-ying （School of Basic Medical Sciences， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

Abstract： Objective To explore the effects of Dachengqi Decoction on morphological changes， lung and spleen indexes， and total IgE levels of mice with allergic asthma； To discuss it relevant mechanism of action. Methods The method of OVA sensitization and provocation was used to establish allergic asthma mice models. 20 C57BL/6 mice were randomly divided into control group， model group， Dachengqi Decoction group and dexamethasone positive group. Each medication group was given relevant medicine for gavage. Lung and spleen indexes in each group were detected. The total IgE levels in serum of mice were detected by ELISA， and HE staining was used to conduct pathological observation. Results Compared with control group， the lung index and level of IgE in model group increased significantly and pulmonary histological results showed abundant inflammatory cells infiltrated in the bronchus； compared with the model group， the lung index as well as the levels of IgE decreased significantly in the Dachengqi Decoction and dexamethasone positive group （P<0.05）， and the lung tissue organization form was improved significantly. Conclusion Dachengqi Decoction has inhibiting effects on pulmonary inflammation of mice with asthma.

Key words： allergic asthma； treatment of lung and large intestine； Dachengqi Decoction； mice

基金項目：國家自然科學基金面上項目（81473656）；北京中醫(yī)藥大學創(chuàng)新團隊項目（2011-CXTD-04）

通訊作者：彭桂英，E-mail：edweiss@163.com

支氣管哮喘是一種以淋巴細胞、嗜酸性粒細胞和肥大細胞反應為主的慢性氣道炎癥性疾病，嚴重影響日常生活，給患者個人、家庭和社會帶來沉重的經濟負擔。目前西醫(yī)對哮喘的治療，主要是通過吸入糖皮質激素抑制氣道炎癥，以及使用支氣管舒張劑緩解支氣管收縮，長期使用不良反應大。因此，尋找新的方法防治哮喘具有重要意義。肺腸理論是臟腑相合理論的重要內容之一，臨床上一直用以指導肺部疾病的治療，尤其是在慢性阻塞性肺疾病和哮喘的治療上具有較好的療效[1-2]。本研究以大承氣湯為方藥，以過敏性哮喘小鼠為動物模型，以肺組織形態(tài)學、肺脾指數及IgE水平為切入點，探究“肺腸同治”法的科學內涵。

1 實驗材料

1.1 動物

健康SPF級C57BL/6小鼠20只，雌性，鼠齡6～8周，體質量18～20 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學動物房屏障系統，溫度（25±1）℃，濕度40%～60%，自由飲食、飲水。

1.2 藥物及制備

大承氣湯（大黃12 g，枳實12 g，厚樸24 g，芒硝9 g）飲片均購自北京同仁堂總店，按人體質量藥量換算小鼠給藥量為19 g/kg。藥物浸泡30 min后，先武火煎煮10 min，再文火煎煮20 min，煎煮2次，合并煎液，將所得藥液用雙層紗布過濾，濃縮至濃度為1.9 g原藥材/mL，4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩５厝姿善?，天津力生制藥有限股份有限公司，批?0140706。

1.3 主要試劑與儀器

IgE ELISA Kit（Bio legend），批號PD201123；卵白蛋白（OVA，Sigma-Aldrich），批號SLBK1339V；PBS（Invitrogen），批號1627690；氫氧化鋁凝膠（Pierce），批號B192991。醫(yī)用霧化器（PARI Turbo BOY N），5415型高速離心機（德國Eppendorf公司），酶標儀DNM- 96021（瑞士Tecan公司），光學顯微鏡（Olympus Co）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模和給藥

實驗小鼠飼養(yǎng)7 d后，隨機分為正常組、模型組、大承氣湯組和陽性藥組，每組5只。參照文獻[3]方法，采用OVA致敏激發(fā)方式構建哮喘小鼠模型。第0、14日每只小鼠腹腔注射含20 ?g OVA和2 mg氫氧化鋁的凝膠混懸液0.2 mL，第21～25日將其置10 cm×20 cm×30 cm自制霧化箱中，用含1%OVA溶液8 mL霧化吸入激發(fā)，每次30 min，每日1次。

大承氣湯組給予大承氣湯藥液灌胃，陽性藥組給予地塞米松（5 mg/kg）藥液灌胃，模型組和正常組給予PBS灌胃。灌胃體積0.2 mL/只。各組于末次霧化12 h后取材。

2.2 血清總IgE含量測定

眼球取血，室溫靜置2 h后，離心收集上清，分裝后凍存于-20 ℃冰箱。ELISA檢測總IgE含量，嚴格按照試劑盒說明操作。

2.3 肺指數和脾指數測定

稱重后，脫頸處死小鼠，打開胸腔取出肺臟，摘除氣管、肺門淋巴結等組織，吸干肺臟表面血液，稱取肺臟質量。同時打開腹腔，取出脾臟，吸干表面液體，稱取脾臟質量。計算出肺指數（小鼠肺質量÷小鼠體質量×100%）和脾指數（小鼠脾質量÷小鼠體質量×100%）。

2.4 肺組織病理觀察

選取左肺上葉組織快速置于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，鏡下拍照。

3 統計學方法

采用SPSS20.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 一般狀況

正常組小鼠體質量穩(wěn)定，毛色順滑有光澤，活動自如；模型組小鼠實驗過程中出現抓耳撓鼻、狂躁不安、喘息、呼吸急促、弓背等表現；經藥物治療后，上述癥狀均減輕、且持續(xù)時間較短。

4.2 大承氣湯對模型小鼠肺指數、脾指數及血清IgE含量的影響

與正常組比較，模型組小鼠肺指數、脾指數和血清IgE含量增高（P<0.01）；與模型組比較，大承氣湯組肺指數降低、脾指數升高（P<0.05），陽性藥組肺指數和脾指數均降低（P<0.01），大承氣湯組和陽性藥組IgE含量降低（P<0.01）。結果見表1。

4.3 病理觀察結果

正常組小鼠肺泡結構完整、清晰，呈現正常肺組織形態(tài)；模型組可見大量炎癥細胞浸潤且出現黏液栓，周圍組織水腫，上皮損傷且纖維化，氣道平滑肌肥大、增生；大承氣湯組和陽性藥組可見支氣管及血管周圍炎癥細胞浸潤減少，周圍組織水腫減輕，氣道上皮損傷、纖維化及基底膜增厚等減輕。結果見圖1。

5 討論

在“肺與大腸相表里”理論的指導下，近年來學者對肺腸軸進行了較深入的研究，進一步闡明了肺與大腸相表里的分子水平機制，并逐漸發(fā)現中醫(yī)藥治療過敏性哮喘相關炎性疾病有其獨特的方藥和理法。徐氏等[4]研究表明，大承氣湯對過敏性哮喘小鼠有明顯的治療作用。因此，本課題以過敏性哮喘小鼠為動物模型，大承氣湯為方藥，挖掘“肺腸同治”的科學實驗證據。大承氣湯首載于《傷寒論》，由大黃、芒硝、枳實、厚樸4味藥組成，具有攻下實熱、消除痞滿之功，主治陽明腑實證，是“肺腸同治”法的代表方。方中大黃與芒硝瀉腑通便，大便通暢，大腸傳導功能正常，則有助于肺氣宣降；枳實、厚樸相須為用，既能行氣破滯散結，又能降肺氣以平喘消痰。諸藥合用，暢通氣機，瀉下實熱，蕩滌燥結，相得益彰。

本實驗結果顯示，過敏性哮喘小鼠發(fā)作期出現明顯的呼吸喘促、狂躁、打噴嚏及頻繁撓鼻，而給予大承氣湯治療后上述癥狀均有所改善。模型組小鼠肺組織出現大量炎癥細胞浸潤，支氣管上皮損傷甚至纖維化、增生，而大承氣湯治療后肺組織形態(tài)明顯好轉。劉氏等[5]發(fā)現僅以芒硝刺激大腸，有助于改善氣道通氣并抑制哮喘小鼠肺部炎癥，這更進一步證實了本結果的可靠性。

此外，本研究發(fā)現大承氣湯能有效降低哮喘小鼠肺指數，這從另一個角度印證了其減輕肺部炎癥的效果，與其他文獻報道一致[6]。而大承氣湯治療后哮喘小鼠脾指數不降反而上升，推測其前述抑制炎癥作用可能與促進淋巴細胞向不同方向分化有關，而非抑制淋巴細胞的增殖。同時，我們還發(fā)現大承氣湯能顯著降低哮喘小鼠總IgE含量，這與國內其他學者使用從腸治肺或肺腸合治法能顯著降低哮喘小鼠血清中總IgE含量的實驗結果一致[5，7]?？紤]到IgE是過敏性哮喘發(fā)生過程中重要的介導因素，其含量的增加與過敏性哮喘的發(fā)生發(fā)展密切相關[8]，而現代免疫學研究發(fā)現，IgE的產生與2型輔助性T淋巴細胞產生的白細胞介素-4（IL-4）密切相關[9]，實際上我們發(fā)現大承氣湯同樣可以降低哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-4的水平。這進一步證實大承氣湯可能通過降低哮喘小鼠IgE含量，從而減輕肥大細胞的脫顆粒反應，導致哮喘小鼠肺部炎癥程度的緩解。這同時表明“肺腸同治”法的可行性。

綜上所述，大承氣湯能夠通過降低過敏性哮喘小鼠血清IgE的含量，改善哮喘小鼠肺指數的升高。本研究為“肺腸同治”法提供了詳實可靠的實驗依據。然而，大承氣湯引起哮喘小鼠脾指數升高從另一個側面提示我們需要進一步研究其具體的機制。

參考文獻：

[1] 石一杰，汪輝.通腑法治療40例慢性阻塞性肺疾病呼吸衰竭患者療效觀察[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2013，10（17）：39-40.

[2] LIU P， WANG P， TIAN D Z， et al. Study on traditional Chinese medicine theory of lung being connected with large intestine[J]. Journal of Traditional Chinese Medicine，2012， 32（3）：482-487.

[3] REDDY A T， LAKSHMI S P， REDDY R C. Murine model of allergen induced asthma[J]. J Vis Exp，2012，63：e3771.

[4] 徐云，李宇航，鄭豐杰，等.通腑對卵清蛋白致敏支氣管哮喘小鼠模型的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志，2012，39（3）：553-555.

[5] 劉妙，鄭豐杰，高譽珊，等.“從腸論治”對哮喘小鼠BALF炎癥細胞及血清IgE含量的影響[J].世界中醫(yī)藥，2015，10（1）：26-29.

[6] 胡亞濤.大承氣湯辨治脂多糖致小鼠急性肺損傷的基礎作用[J].時珍國醫(yī)國藥，2014，25（11）：2632-2633.

[7] 白亞輝，陳輝，楊宇.肺腸合治法對哮喘小鼠血清總IgE影響的實驗研究[J].中華中醫(yī)藥學刊，2007，25（6）：1131-1133.

[8] SANITAS K， DELIMPOURA V， ZERVAS E，et al. Anti-IgE treatment， airway inflammation and remodeling in severe allergic asthma： current knowledge and future perspectives[J]. Eur Respir Rev， 2015，24（138）：594-601.

[9] OESER K， MAXEINER J， SYMOWSHI C， et al. T cells are the critical source of IL-4/IL-13 in a mouse model of allergic asthma[J]. Allergy，2015，70（11）：1440-1449.

（收稿日期：2015-12-24；編輯：華強）