手足口病中醫證型與血清炎性細胞因子、T細胞亞群、NK細胞相關性分析

黃偉 李芹

摘要：目的 研究手足口病（HFMD）肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證、毒熱動風證與白細胞介素-6（IL-6）、降鈣素原（PCT）、C反應蛋白（CRP）及CD3+、CD4+、CD8+ T細胞、NK細胞之間的相關性。方法 隨機選取90例HFMD患者，肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證、毒熱動風證各30例，檢測血清炎性細胞因子（IL-6、PCT、CRP）、T細胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+）、NK細胞等指標，分析上述指標在各證型間的分布情況。結果 毒熱動風證IL-6、PCT、CRP水平明顯高于肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證，差異均有統計學意義（P<0.01）；CD3+、CD4+、CD8+、NK細胞絕對值毒熱動風證與肺脾濕熱證組、濕熱郁蒸證組間比較差異均有統計學意義（P<0.01）；CD3+細胞百分比毒熱動風證組與肺脾濕熱證組間比較差異均有統計學意義（P<0.01），與濕熱郁蒸證組間差異有統計學意義（P<0.05）；CD4+細胞百分比毒熱動風證組與肺脾濕熱證組間比較差異有統計學意義（P<0.05），與濕熱郁蒸證組間比較差異有統計學意義（P<0.01）；CD8+、NK細胞百分比毒熱動風證組與肺脾濕熱證組、濕熱郁蒸證組間比較差異均有統計學意義（P<0.01）。結論 HFMD肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證、毒熱動風證在相關炎性細胞因子、促炎標志物及T細胞亞群等方面不僅與發病有關，并且與病情輕重及預后密切相關，能夠較為有效地評估病情及判斷預后。

關鍵詞：手足口病；白細胞介素-6；降鈣素原；C反應蛋白；T細胞亞群

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.07.005

中圖分類號：R259.125 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）07-0017-05

Analysis on Correlation Between TCM Syndromes of Hand， Foot and Mouth Disease and Serum Proinflammatory Cytokines， T Cell Subgroup and NK Cells HUANG Wei， LI Qin （Fuzhou Infectious Disease Hospital， Fuzhou 350000， China）

Abstract： Objective To study the correlation between hand， foot and mouth disease （HFMD） in lung-spleen damp-heat syndrome， syndrome of stagnation and steaming due to damp-heat， and syndrome of stirring wind due to toxic-heat with IL-6， PCT， CRP， CD3+， CD4+， CD8+ and NK cells. Methods Ninety patients with HFMD were randomly selected， dividing into lung-spleen damp-heat syndrome， syndrome of stagnation and steaming due to damp-heat， and syndrome of stirring wind due to toxic-heat， 30 cases for each syndrome. IL-6， PCT， CRP， CD3+， CD4+， CD8+ and NK cells were detected， and the distribution of above indicators in the three syndromes were analyzed. Results Levels of IL-6， PCT and CRP in syndrome of stirring wind due to toxic-heat were significantly higher than those in lung-spleen damp-heat syndrome and syndrome of stagnation and steaming due to damp-heat， with statistical significance （P<0.01）； There was statistical significance in absolute value counting of CD3+， CD4+， CD8+ and NK cells among the three syndromes （P<0.01）； There was statistical significance in the percentage of CD3+ cells in syndrome of stirring wind due to toxic-heat and lung-spleen damp-heat syndrome （P<0.01） and syndrome of stagnation and steaming due to damp-heat （P<0.05）； There was statistical significance in the percentage of CD4+ cells

基金項目：國家科技重大專項-艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治（2012ZX10004301-005）；福州市衛生系統科技計劃項目（2013-S-wt8）

通訊作者：李芹，E-mail：liqing05912006@163.com

syndrome of stirring wind due to toxic-heat and lung-spleen damp-heat syndrome （P<0.05） and syndrome of stagnation and steaming due to damp-heat （P<0.01）； There was statistical significance in the percentages of CD8+ and NK cells in the three syndromes （P<0.01）. Conclusion Proinflammatory cytokines， proinflammatory markers， and T cell sub-group related to HFMD in lung-spleen damp-heat syndrome， syndrome of stagnation and steaming due to damp-heat， syndrome of stirring wind due to toxic-heat are not only correlative with morbidity， but also with the severity of diseases and prognosis， which can relatively effectively evaluate the state of diseases and judge prognosis.

Key words： hand， foot and mouth disease； IL-6； calcitonin original； C-reactive protein； T cell sub-group

手足口?。℉FMD）是一種常見兒童感染性疾病，約70%是由柯薩奇病毒A 16型（COX A16）和腸道病毒71型（EV71）引起[1-2]，主要癥狀為發熱、手足臀等部位及口腔出現斑丘疹或皰疹[3]?！妒肿憧诓≡\療指南（2010年版）》[4]將該病分為肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證、毒熱動風證、心陽衰微肺氣欲脫證4種證型。根據本院收治患兒特點及病例數量，患兒大多集中在肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證、毒熱動風證這3個證型。本研究采集HFMD患者血液樣本，對白細胞介素-6（IL-6）、降鈣素原（PCT）、C反應蛋白（CRP）、T細胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+）等指標進行檢測，分析HFMD不同證型在上述檢測指標之間的差異及相關性，為中醫在臨床工作中與實驗室理化指標相結合提供循證醫學證據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究病例均來自福州市傳染病醫院感染科門診2014年8月-2015年6月收治的HFMD患者。按隨機數字法選取90例，入院即按順序編號，然后按隨機數表第一行第一列分配隨機數，3種證型的隨機數為偶數者納入本研究。肺脾濕熱證共編號58例，納入30例（男13例，女17例）；濕熱郁蒸證共編號64例，納入30例（男14例，女16例）；毒熱動風證共編號55例，納入30例（男19例，女11例）。本研究經本院倫理委員會批準，相關檢查項目均獲得患兒監護人知情同意。3組患者年齡、性別、病程差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性，見表1。

1.2 納入標準

①年齡最小6個月，最大6歲；②病程在48 h內；③符合《手足口病診療指南（2010年版）》[4]中肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證、毒熱動風證中醫臨床診斷標準。肺脾濕熱證主癥：發熱，手、足和臀部出現斑丘疹、皰疹，口腔黏膜出現散在皰疹，咽紅、流涎，神情倦怠，舌淡紅或紅，苔膩，脈數，指紋紅紫。濕熱郁蒸證主癥：高熱，疹色不澤，口腔潰瘍，精神萎頓，舌紅或絳、少津，苔黃膩，脈細數，指紋紫黯。毒熱動風證主癥：高熱不退，易驚，嘔吐，肌肉瞤動，或見肢體痿軟，甚則昏矇，舌黯紅或紅絳，苔黃膩或黃燥，脈弦細數，指紋紫滯；④患兒監護人簽署知情同意書。

1.3 排除標準

①HFMD核酸檢測未檢出相關病毒者；②合并其他嚴重器質性疾病、發育不健全者；③合并其他病毒感染如巨細胞、EB病毒感染及HIV、水痘、麻疹者。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 血清細胞因子、T細胞亞群、NK細胞 患者均于就診當日抽取靜脈血3 mL，3000 r/min離心10 min（美國Beckman GS-15R離心機），留取血清，無菌分裝后置于-80 ℃冰箱備用（T細胞亞群檢測均于抽血后常溫保存并在4 h內檢測）。IL-6、PCT檢測均應用羅氏電化學發光法診斷試劑，采用羅氏E601全自動免疫分析儀檢測；CRP檢測使用BodiTech i-CHROMA試劑盒及配套艾可美分析儀。CD3+、CD4+、CD8+、NK細胞采用美國Becton Dickinson流式細胞儀及配套試劑檢測。均按照相關說明書嚴格操作。

1.4.2 腸道病毒核酸分型 患者均于就診當日采集肛拭子標本，用中山大學達安公司生產的診斷試劑盒，美國生命科學公司Step one plus-Real Time PCR儀定量分析。取約2g糞便于離心管中，加入10 mL磷酸鹽緩沖液、2g玻璃珠、1 mL氯仿，振蕩混勻，3500 r/min離心20 min，取上清液140 ?L，提取RNA。反應體系為25 ?L：熒光RT-PCR反應液20 ?L，DNA聚合酶1 ?L，反轉錄酶0.35 ?L，模板RNA 5 ?L，充分混勻，6000 r/min離心10 s。實時熒光RT-PCR擴增程序：50 ℃反轉錄30 min；95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 min，共5個循環；95 ℃變性10 s，55 ℃退火40 s，采集熒光，共40個循環。

1.5 統計學方法

采用SPSS18.0統計軟件進行分析。計量資料用 —x±s表示，組間比較采用χ2檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 中醫證型與血清促炎因子的相關性

毒熱動風證IL-6明顯高于另兩證（P=0.003）；毒熱動風證PCT明顯高于另兩證（P=0.000）；毒熱動風證CRP也明顯高于另兩證（P肺脾濕熱證=0.002，P濕熱郁蒸證=0.037）。肺脾濕熱證與濕熱郁蒸證IL-6、PCT、CRP比較差異無統計學意義。結果見表2。

2.2 中醫證型與T細胞亞群計數的相關性

毒熱動風證CD3+計數與肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證間比較差異均有統計學意義（P=0.005，P=0.006）；毒熱動風證CD4+計數與另兩證比較差異均有統計學意義（P=0.000）；毒熱動風證CD8+計數與另兩證比較差異均有統計學意義（P=0.005，P=0.000）；毒熱動風證NK細胞計數與另兩證比較差異有統計學意義（P=0.000）。肺脾濕熱證與濕熱郁蒸證CD3+、CD4+、CD8+、NK細胞計數比較差異無統計學意義。結果見表3。

2.3 中醫證型與T細胞亞群百分比的相關性

毒熱動風證CD3+百分比與另兩證比較差異有統計學意義（P肺脾濕熱證=0.012，P濕熱郁蒸證=0.041）；毒熱動風證CD4+百分比與另兩證比較差異有統計學意義（P肺脾濕熱證=0.033，P濕熱郁蒸證=0.001）；毒熱動風證CD8+百分比與另兩證比較差異有統計學意義（P肺脾濕熱證=0.008，P濕熱郁蒸證=0.000）；毒熱動風證NK細胞百分比與另兩證比較差異有統計學意義（P肺脾濕熱證=0.000，P濕熱郁蒸證=0.000）。肺脾濕熱證與濕熱郁蒸證CD3+、CD4+、CD8+、NK細胞百分比比較差異無統計學意義。結果見表4。

2.4 中醫證型與核酸病毒分型的相關性分析

經核酸病毒分型檢測，肺脾濕熱證中Cox A16型19例、EV71型8例、其他通用型3例；濕熱郁蒸證中Cox A16型21例、EV71型4例、其他通用型5例；毒熱動風證中Cox A16型21例、EV71型4例、其他通用型5例?？梢?，毒熱動風證中EV71型病毒感染明顯高于另兩證，肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證均以感染Cox A16為主，而毒熱動風證以感染EV71型病毒為主，組間比較差異有統計學意義（χ2=52.74，P=0.002），結果見表5。

3 討論

中醫無HFMD相關病名，現代中醫家多將其歸為“溫病”范疇。該病多由學齡期小兒感染，該時期小兒臟氣未充，正氣不足，病邪易于乘虛而入，損傷正氣，主要證素為濕和熱，感染疫毒癘氣之邪后導致氣機逆亂和氣虛，表現為發熱、精神差等，熱毒夾濕從皮膚口鼻而入，濕熱郁于肌表，則見手足丘皰疹；內傳心脾，心脾積熱，濕熱郁蒸，阻滯氣機，表現為咳嗽、嘔吐、納差、腹痛?；馃嶂耙讉騽语L耗氣，擾動肝風，出現肢體抖動、煩躁、驚跳等神經系統癥狀[5]?！端貑枴ぴu熱病論篇》有“邪之所湊，其氣必虛”，加之為小兒稚陰稚陽之體，素體內熱偏勝，脾胃積熱，脾常不足，且多嗜食肥膩甘甜之品，易脾胃積熱，脾失健運，濕熱內蘊，外加感受邪毒，內應于脾而發病，濕熱相搏[6]，正氣抗邪外出，毒隨氣泄，外透肌膚，則見皰疹，甚者濕熱內浸，波及氣營，則出現氣營兩燔證，表現為高熱不退、皰疹密集等癥。臨床根據HFMD辨證分型為肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證2個普通證型及毒熱動風證1個重癥證型，3種證型在IL-6、PCT、CRP、CD3+、CD4+、CD8+、NK細胞等方面均存在差異。IL-6是機體內的促炎因子，在HFMD發病過程中與機體免疫防疫、炎性損傷等病理生理過程有關[7]，HFMD由腸道病毒感染引起，導致一系列免疫調節損傷及炎癥反應，而促炎細胞因子在該過程中發揮著重要作用[8]。本研究中，肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證的IL-6水平明顯低于毒熱動風證，且差異有統計學意義，表明毒熱動風證較另2個較輕證型IL-6水平表達異常，提示IL-6可能與HFMD病情密切相關。PCT是降鈣素的前體，正常情況時主要在甲狀腺濾泡旁細胞內合成，一般在嚴重感染及創傷等情況下明顯升高，同樣也參與炎癥反應，在臨床中多用于監測感染輕重程度[9]。PCT具有早期、特異、敏感的特性，優于傳統的炎性標志物，且對病情的早期評估、預后評價、療效觀察等具有一定意義[10]。3組患兒中，肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證的PCT水平明顯低于毒熱動風證，且差異有統計學意義，表明毒熱動風證較其他2個較輕證型的PCT水平表達異常，提示PCT的表達可能與HFMD病情密切相關，在一定程度上能反映疾病的嚴重程度。CRP是一種急性時相反應蛋白，主要由IL-6刺激肝臟和上皮細胞合成和分泌，也是炎癥反應的非特異性指標，在HFMD早期診斷中有一定價值[11]。本研究中，肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證的CRP水平明顯低于毒熱動風證，且差異有統計學意義，說明CRP的高低對疾病的嚴重程度評估有一定意義。T淋巴細胞是機體免疫反應細胞，也是免疫調節細胞，能起到調節機體正常免疫功能的作用，正常情況下CD3+、CD4+、CD8+計數及百分比均維持動態平衡，以維持機體免疫功能穩定[12]。在本研究中，毒熱動風證CD3+、CD4+、CD8+計數及百分比均低于肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證，HFMD時感染腸道病毒，導致機體免疫機制失調，T淋巴細胞亞群分布異常[13]，B淋巴細胞表達和分泌的血清免疫球蛋白受T淋巴細胞調節，當CD4+細胞減少或功能低下時，其產生淋巴因子協助B淋巴細胞產生抗體的能力也相對減弱[14]。機體免疫力下降既是HFMD感染的前提，也是病情加重、影響預后的重要因素。毒熱動風證屬重證HFMD，相較于其他2個普通證型，細胞免疫功能明顯低下，在疾病發展過程中檢測T細胞亞群水平，既能綜合評估病情，又能評估預后及轉歸。NK細胞是人體內固有免疫中的一種重要的效應細胞，它可以繞過T細胞受體（TCR）/CD3識別途徑，以主要組織相容性復合物（MHC）非限制方式迅速識別和殺滅入侵的病原菌，同時分泌大量干擾素-γ等細胞因子，上調吞噬細胞的吞噬功能，在抗感染、抗腫瘤等方面發揮突出的作用，NK細胞的升高能在HFMD轉歸及預后方面有積極作用[15]。在本研究中，毒熱動風證的NK細胞計數及百分比均高于另兩證，提示在抗感染的過程中，重癥患者的NK細胞表達水平更高，可能針對病毒感染的機體免疫反應更強烈，也在一定程度上反映了疾病的輕重程度，本研究中毒熱動風證患者預后均良好，也提示在判別預后方面NK細胞可能有一定作用。目前流行的腸道病毒以Cox A16和EV71型居多，普通型以前者居多，重癥仍以感染EV71型病毒為主。

本研究在HFMD肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證、毒熱動風證3個證型中發現相關的促炎細胞因子、促炎標志物及T細胞亞群等方面不僅與發病有關，并且與病情輕重及預后密切相關。在臨床診治HFMD工作中，綜合檢測上述指標能夠較為有效的評估病情及判斷預后。在HFMD診療中，以上述檢測指標結合中醫臨床辨證分型，能夠更好地指導中醫臨床，為中醫臨床診斷客觀化及量化提供重要依據。

參考文獻：

[1] TIAN H， YANG Q Z， LIANG J， et al. Clinical features and management outcomes of severehand， foot and mouth disease[J]. Medical Principles and Practice，2012，21（4）：355-359.

[2] ZHANG J， SUN J， CHANG Z， et al. Characterization of hand， foot， and mouth disease in China between 2008 and 2009[J]. Biomedical and Environmental Sciences，2011，24（3）：214-221.