BALB/c小鼠不同體質量范圍對重組人促紅素注射液體內活性測定的影響

邵寶珠, 唐其鳳, 曹麗麗(沈陽三生制藥有限責任公司, 沈陽 110027)

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BALB/c小鼠不同體質量范圍對重組人促紅素注射液體內活性測定的影響

邵寶珠, 唐其鳳, 曹麗麗
(沈陽三生制藥有限責任公司, 沈陽 110027)

[摘要]目的 以《中國藥典》的促紅素各論為基礎，探討在重組人促紅素(rhEPO)體內活性測定時，6～8周齡SPF級BALB/c小鼠, 不同體質量對試驗結果變異率的影響。方法 按小鼠體質量分為14～22 g、18～20 g、15～20 g和16～18 g組，測定不同體質量對rhEPO反應值穩定性、線性和重復性的影響。結果 使用體質量16～18 g、18～20 g小鼠測定的結果變異率低。結論 rhEPO體內活性測定應選用6～8周齡、體質量16～20 g的BALB/c小鼠。

[關鍵詞]BALB/c小鼠; 重組人促紅素(rhEPO); 體內生物學活性; 體質量

人促紅素(hEPO)是一種肽類激素，能夠刺激體內的紅細胞增多。主要產生于腎臟，分泌后進入人血液中，作用于骨髓中的紅祖細胞，使其加速分化，刺激網織紅細胞生成和成熟紅細胞釋放。重組人促紅素(rhEPO)是利用基因工程技術，將hEPO轉入哺乳動物細胞內高效表達的糖蛋白，由165個氨基酸組成，用于治療慢性腎功能衰竭和癌癥化療所產生的貧血[1]。rhEPO也是最早用于臨床的基因工程藥物之一。

《中國藥典》和《歐洲藥典》明確規定了對rhEPO體內生物學活性的檢測方法。兩者均采用網織紅細胞法，該方法是給小鼠皮下注射一定劑量的rhEPO，利用rhEPO刺激網織紅細胞生成的作用，使其網織紅細胞對紅細胞的百分含量增加，即在一定范圍內rhEPO物質的量與體內網織紅細胞的百分含量成正比。利用統計學雙平行線法對實驗數據分析得出樣品的體內生物學活性?！稓W洲藥典》規定使用8周齡雌性B6D2F1小鼠，每劑量組8只[2];《中國藥典》規定使用6～8周齡雌性BALB/c小鼠，每劑量組至少4只[3]，均沒有明確規定小鼠的體質量。此方法使用具有正常紅細胞生成能力的小鼠，其優點是對促紅素臨床藥效反應有更直接響應，動物容易獲得，且遺傳性狀穩定。但是動物試驗有其天然缺陷即變異率高，為降低變異率，《歐洲藥典》和《中國藥典》明確了小鼠周齡和小鼠品系，十幾年的運行證實該方法有效。本研究目的是以此為基礎，探索控制小鼠體質量范圍降低變異率，擬采用《中國藥典》規定的6～8周齡雌性BALB/c小鼠，測定不同體質量范圍對rhEPO體內生物學活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雌性BALB/c小鼠， 6～8周齡，912只，沈陽三生制藥有限責任公司動物實驗中心生產[SCXK(遼)2013-0002]。

1.2 藥品、試劑與儀器

rhEPO注射液(CHO細胞), 4 000IU/支, 沈陽三生制藥有限責任公司生產。工作標準品, 770 IU/mL,沈陽三生制藥有限責任公司自制。BSA購自澳大利亞Bovogen公司; 氯化鈉購自天津海光藥業有限公司。EDTA-2K購自國藥集團化學試劑有限公司。熒光染料、Cell-pack稀釋液、Cell-clean清洗液購自Sysmex公司。樣品稀釋液為含有質量分數0.1%牛血清白蛋白(BSA)的生理鹽水?？鼓齽楹匈|量分數1% EDTA-2K的生理鹽水。R-500全自動網織紅細胞計數儀購自日本Sysmex公司。電子天平(最大稱量200 g，分辨率0.01 mg)、電子分析天平(AP250D，0.000 1 mg)購自成都巿新津事豐醫療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同體質量對rhEPO反應值穩定性的影響選擇SPF級BALB/c雌性小鼠24只，隨機分為14～22 g、18～20 g、15～20 g、16～18 g 4組, 每組6只,將供試品稀釋至80 IU/mL，注射劑量0.5 mL/只，分別于0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h從小鼠尾靜脈采血10 mL置于含有1% EDTA-2K的50 mL生理鹽水F套管中充分混勻，將抗凝血用R-500全自動網織紅細胞計數儀計數紅細胞總數、網織紅細胞總數并計算網織紅細胞數對紅細胞總數的比值(Ret%)。

1.3.2 不同體質量對rhEPO反應值線性關系的影響168只小鼠隨機分為14～22 g、18～20 g、15～20 g、16～18 g組, 每組42只, 將供試品稀釋至2.5 IU/mL、5 IU/mL、10 IU/mL、20 IU/mL、40 IU/mL、80 IU/mL、160 IU/mL，每劑量組注射6只，注射劑量0.5 mL/只，注射后96 h從小鼠眼眶后靜脈叢采血3～4滴，置于含有1% EDTA-2K的200 mL生理鹽水F套管中充分混勻，其余按1.3.1操作。

1.3.3 不同體質量對rhEPO體內生物學活性重復性的影響 72只小鼠隨機分為14～22 g、18～20 g、15～20 g 、16～18 g組，每組18只，按照雙平行線法的實驗要求和特點，設定3個注射劑量組，將樣品和工作標準品稀釋至80 IU/mL、40 IU/mL、20 IU/mL, 于小鼠的腹側皮下注射, 其余按1.3.1操作。重復以上實驗9次，計算相對偏差(RSD)=標準偏差(s)/平均值()×100%。

2 結果

2.1 不同體質量對rhEPO反應值穩定性的影響

0～72 h的Ret%隨時間延長穩步升高，72 h達到最高并維持至96 h，120 h的Ret%值明顯下降，72～96 h小鼠體質量范圍18～20 g組、16～18 g組的反應值比較穩定(表1)。

2.2 不同體質量對rhEPO反應值線性的影響

結果表明，小鼠體質量18～20 g組、16～18 g組的線性較好(表2)。

表1 小鼠不同體質量對rhEPO反應值穩定性的影響 Ret%

表2 小鼠不同體質量對rhEPO反應值線性的影響 Ret%

2.3 小鼠不同體質量對rhEPO體內生物學活性測定重復性的影響

結果表明，小鼠體質量18～20 g組重復性最好，16～18 g組重復較好，15～20 g組重復性一般，隨機組(14～22 g)重復性較差(表3)。

3 討論

rhEPO為糖蛋白, 糖鏈的完整性直接影響rhEPO分子在體內的穩定性和活性[4]，對失去或部分失去糖鏈的rhEPO分子即使在體外生物學活性很高，但體內生物學活性也不會很高。因此，體內生物活性測定是rhEPO注射液監測的關鍵指標之一?！稓W洲藥典》、《中國藥典》規定檢測rhEPO體內生物學活性使用小鼠的品系、周齡和數量，未規定動物的體質量。本研究表明, 6～8周齡BALB/c雌性小鼠, 體質量范圍隨機組14～22 g對rhEPO反應值的穩定性、線性(變異率為51.5%)以及重復性相對標準偏差(17%)均不如其它3個組別的數據穩定, 且復測率高。體質量范圍在16～18 g、18～20 g測定的結果最為穩定，重復性好，復測率低。

表3 小鼠不同體質量對rhEPO體內生物學活性測定重復性的影響

在控制實驗動物周齡和體質量后，本研究未進行不同品系的研究。小鼠實驗結果表明，控制體質量范圍可以減低變異率。我們認為在《中國藥典》和《歐洲藥典》促紅素體內活性測試方法的基礎上，可以對實驗動物體質量范圍的進行適當控制，以降低試驗的變異率。

參考文獻：

[1] 周勇, 王箐舟. 重組人紅細胞生成素質量控制體系研究[J].中國生物制品學雜志, 2007, 20(8):586-587.

[2] 《歐洲藥典》7.0版[S]. 01/2008:1316.

[3] 《中國藥典》2010版.三部各論: 重組人促紅素注射液[S]. [4] 周勇, 王箐舟. 重組人促紅素體內、體外生物學活性差異成因分析[J]. 中國生物制品學雜志, 2008, 21(2):136-138.

[中圖分類號]Q95-33

[文獻標識碼]B

[文章編號]1674-5817(2016)03-0216-03

doi:10.3969/j.issn.1674-5817.2016.03.012

[收稿日期]2015-08-24

[作者簡介]邵寶珠(1979-), 男, 碩士, 工程師, 研究方向: 生物制藥工程。E-mail: Shaobaozhu@3sbio.com

[通信作者]唐其鳳, 女, 工程師, 研究方向: 實驗動物學。E-mail:Tangqifeng@3sbio.com