小鼠腦缺血時自噬相關基因5的抗損傷作用*

彭志鋒，　王喜英，　楊靖輝

(山西大同大學醫學院 1生理教研室， 2微生物與免疫學研究所，山西 大同 037009)

小鼠腦缺血時自噬相關基因5的抗損傷作用*

彭志鋒1△，王喜英2，楊靖輝1

(山西大同大學醫學院1生理教研室，2微生物與免疫學研究所，山西 大同 037009)

[摘要]目的： 觀察自噬相關基因5(Atg5)在小鼠腦缺血再灌注損傷中的抗損傷作用。方法：將雄性BALB/c小鼠隨機分為假手術(sham)組、缺血再灌注(I/R)組、Atg5 siRNA組和control siRNA組。I/R組采用大腦中動脈阻塞(MCAO)60 min后再灌注24 h。Atg5 siRNA組和control siRNA組將5 μL Atg5 siRNA或scrambled siRNA在MCAO前24 h側腦室注射。實時熒光定量PCR和Western blot檢測Atg5的表達；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法檢測抑制Atg5對缺血再灌注損傷后腦梗死面積和水腫率的影響；神經行為學評分法檢測抑制Atg5對缺血再灌注損傷后神經癥狀的影響。結果：MCAO后再灌24 h，缺血半影區Atg5 mRNA和蛋白水平顯著增高(P<0.05)；Atg5 siRNA明顯降低缺血再灌后Atg5 mRNA和蛋白的表達(P<0.05)；側腦室給予Atg5 siRNA能顯著增加腦梗死面積和水腫率，并加重神經行為學損傷(P<0.05)。結論：沉默Atg5加重小鼠腦缺血再灌損傷，提示MCAO后誘導的 Atg5 可減輕小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷。

[關鍵詞]自噬相關基因5； 自噬； 缺血再灌注損傷

缺血性腦血管疾病因其發病急，而且致殘致死率高，已經成為危害人類健康的一類重大疾病[1]。在缺血性腦血管病治療過程中不可避免會出現再灌注損傷。然而，臨床上仍然缺乏有效的治療再灌注損傷的藥物和措施。

自噬是通過自噬溶酶體系統對自身細胞質內異物、損傷和衰老細胞器進行吞噬降解的過程，它可以使蛋白等能量物質循環再利用，對細胞生長、器官正常發育具有重要的作用[2]。大量的研究顯示，在哺乳動物腦缺血模型中，包括缺氧-缺血和局灶或全腦缺血模型，都可誘發神經元自噬[3-4]。自噬相關基因5(autophagy-related gene 5，Atg5)是參與自噬調控的重要基因，位于人類染色體6q21，編碼276個氨基酸[5]。Atg5定位于自噬體膜的表面，促進了自噬體膜的伸展擴張，誘導自噬體形成，是自噬體形成所須的重要因素。研究發現，敲除Atg5可導致小鼠自噬功能不全而于出生后數小時內死亡[6]。最近我們的研究證實下調miR-181b減輕小鼠腦缺血性損傷，具有神經保護作用，可能是通過上調其靶基因Atg5發揮作用的[7]。然而Atg5在小鼠再灌注損傷中的作用未見相關報道。因而，本研究借助大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)致小鼠腦缺血模型，探討Atg5在小鼠再灌性損傷中的作用。

材料和方法

1動物和分組

健康成年(12～14周)、雄性BALB/c小鼠，體重18～22 g，購自首都醫科大學動物部，許可證號為SCXK-(軍)2007-004。將雄性BALB/c小鼠隨機分為4組：假手術(sham)組、缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)組、Atg5 siRNA組和control siRNA組。

2儀器和試劑

小鼠腦立體定位儀(北京沙東生物有限公司)；Mx3000PTM實時熒光定量PCR儀(Agilent)；Atg5 si-RNA和control siRNA(Ribobio)；兔抗Atg5多克隆抗體、鼠抗β-actin多克隆抗體(Sigma)；熒光定量PCR試劑盒(上海敏科生物科技有限公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)購自Sigma；基因特異性引物由上海生工合成。

3主要方法

3.1MCAO誘導局部腦缺血再灌模型制備腹腔注射1%戊巴比妥鈉(0.06 g/kg)麻醉小鼠，自頸部行1 cm長的正中縱切口，鈍性分離下頜下腺，暴露胸鎖乳突肌。手術顯微鏡下暴露左側頸動脈鞘并游離出頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈，然后用5/0縫合絲線雙重結扎頸總動脈近心端和頸外動脈遠心端；在頸總動脈上兩線結間打一松結并輕輕提起以阻斷血流，在頸外動脈遠端的動脈壁上用針頭扎一個小口，將制備好的線栓(頭端直徑0.23 mm、主干直徑0.18 mm)從小孔插入頸總動脈至頸內動脈并進而向上到達大腦中動脈(直至遇到輕微阻力，深度約12.0 mm)，固定線栓，將下頜下腺歸位，60 min 后拔出線栓，縫合皮膚。模型成功的標志是小鼠麻醉清醒后出現手術側肢體癱瘓，站立不穩，小鼠可存活1周。MCAO手術成功率約為70%。Sham組只進行手術操作，不插入線栓。整個手術過程平均20 min完成，此間保持小鼠體溫，術后放入有清潔墊料的飼養盒中，自由飲水、進食。

3.2側腦室給藥小鼠在MCAO手術前先經1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后固定于小鼠腦立體定位儀上，局部用利多卡因局麻后行正中切口，按Munoz側腦室注射方法[8]，以前囟為零點，在前囟后0.5 mm，左側1.0 mm和3.5 mm深度將5 μL的Atg5 siRNA(2 g/L)或scramble siRNA分別5 min內注入小鼠左側腦室，注射完畢靜待5 min后輕輕地拔出微量注射器，注射結束后縫合頭部皮膚24 h再進行MCAO模型制備。

3.3Western blot分析提取大腦缺血半影區[9]總蛋白，取30 μg進行SDS-PAGE，然后轉至PVDF膜上。經5%牛奶孵育1 h后，并用磷酸鹽緩沖液(PBS-T)洗膜3次，每次10 min。用兔抗Atg5多克隆抗體(1∶1 000)和鼠抗β-actin多克隆抗體(1∶2 000) 4 ℃孵育3 h，PBS-T洗3次，每次10 min。用PBS-T稀釋山羊抗兔和山羊抗鼠的 II 抗(1∶25 000)，室溫孵育1 h。PBS-T洗3次，每次5 min。洗膜后用化學發光掃描系統檢測并攝片，以β-actin為內參照，應用圖像分析軟件Quantity One進行吸光度積分值分析。

3.4實時熒光定量PCR首先用mirVanaTMmiRNA Isolation Kit提取大腦缺血半影區總RNA，應用miRCURY LNATMUniversal RT microRNA PCR進行反轉錄反應，再用特異性引物進行實時熒光定量PCR擴增。引物序列如下：Atg5的上游引物序列為5’-TGGCCTACTGTTCGATCTTCT-3’， 下游引物序列為5’-ACAGTGCAGAAGGTCCTTTTC-3’；beclin-1的上游引物序列為5’-CTGATGGTGGCACCATGGA-3’， 下游引物序列為5’-GCCAGACATGATGTCAAAAAG-3’。通過分析軟件得到每組的Ct值，其中U6 RNA作為內參照；參照文獻報道的方法，按下述公式進行比較不同處理后基因相對表達的計算：相對基因表達=2-(ΔCt sample-ΔCt control)[10]。

3.5神經行為學評價 MCAO后再灌24 h，根據文獻報道方法[11]進行神經行為學評分，觀察性評價指標包括運動減少、姿勢側傾、拖地步態、共濟失調等；操作性評分指標包括低反應性、前肢屈曲、肌肉強度降低、身體旋轉和運動失調等。分值越高，代表損傷越嚴重。

3.6TTC染色神經行為學評分后，將小鼠迅速斷頭取腦，-20 ℃冷凍約15 min后行厚1.5 mm的冠狀切片，將腦片迅速置于1%的TTC磷酸鹽緩沖液中，37 ℃避光孵育約10 min，正常腦組織染為深紅色，腦梗死區不著色(灰白色)。根據文獻報道計算腦梗死體積以及水腫率[12]。

4統計學處理

實驗數據用SPSS 17.0統計軟件分析，結果以均數±標準差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組間比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1小鼠腦缺血再灌注損傷后自噬調節基因表達的變化

與sham組相比，I/R組的Atg5和beclin-1 mRNA表達顯著增高(P<0.05)。Atg5 siRNA組小鼠Atg5 mRNA表達明顯降低(P<0.05)，而beclin-1 mRNA的表達無明顯變化，見圖1。

Figure 1.The mRNA expression of Atg5 and beclin-1 in defferent groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssham;#P<0.05vsI/R.

圖1不同組間Atg5和beclin-1的mRNA表達情況

2小鼠腦缺血再灌注損傷后Atg5蛋白水平表達的變化

與sham組相比，I/R組Atg5表達顯著增高(P<0.05)；MCAO手術前側腦室注射Atg5 siRNA后， Atg5蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；control siRNA組Atg5蛋白表達與sham組相比差異無統計學意義，見圖2。

Figure 2.The protein expression of Atg5 in defferent groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssham;#P<0.05vsI/R.

圖2不同組間Atg5蛋白的表達情況

3Atg5 siRNA對MCAO后小鼠神經行為損傷的影響

缺血再灌24 h后對小鼠的神經行為表現進行觀察，發現sham組小鼠神經行為學表現基本正常，神經行為學評分為2.1±0.9。缺血再灌性損傷使小鼠的神經行為學功能受到嚴重損傷，具體表現為活動減少、側傾、轉圈、低反應性、前肢屈曲和運動失調等，神經行為學評分上升為8.5±0.2(P<0.05)。MCAO手術前側腦室注射Atg5 siRNA使行為學損傷進一步加重，行為學評分上升至11.5±0.3，與I/R組相比差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1　各組神經行為學評分

The percentage indicated the proportion of the positive behaviors showed up in different groups.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group.

4Atg5 siRNA對MCAO后小鼠腦梗死體積和水腫率的影響

TTC染色發現，sham組全腦切片染色為均勻紅色，無缺血灶。I/R組有明顯的小鼠局灶性腦缺血[(36.3±0.9)%]，此外，小鼠缺血側皮層發生了明顯的水腫[(11.2±0.5)%]。與前述神經評分檢測結果一致，側腦室注射Atg5 siRNA后，抑制自噬的保護作用并使梗死體積[(47.2±1.3)%]和水腫率[(17.1±0.8)%]明顯增加(P<0.05),見圖3。

Figure 3.The effects ofAtg5 siRNA on infarct volume and edema ratio in the mouse brain after MCAO. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsI/R.

圖3沉默Atg5對MCAO后小鼠腦梗死體積和水腫率的影響

討論

本研究結果顯示，小鼠腦缺血再灌注損傷后半影區Atg5和beclin-1 mRNA的表達增加，Atg5 siRNA降低Atg5 mRNA的表達。與此同時，缺血再灌后Atg5蛋白表達水平增高，Atg5 siRNA也可降低Atg5蛋白表達。Atg5 siRNA使MCAO后神經行為學損傷進一步加重。Atg5 siRNA也使缺血再灌后腦梗死體積和水腫率明顯增加。上述結果表明Atg5在小鼠腦缺血再灌性損傷后具有神經保護作用。

缺血性腦損傷，包括缺血核心區及其周圍的缺血半影區。缺血半影區是由側枝循環提供的血液低灌注區域，部分地維持了神經細胞代謝和信號轉導功能，主要以細胞凋亡、自噬等為主，但在一定時間內仍具有代謝活性，其損害是可逆的，能夠通過及時治療得到挽救[13]。有研究報道，新生大鼠缺氧缺血后beclin-1蛋白水平和陽性細胞數量顯著增高和增加，應用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤和渥曼青霉素可加速神經細胞壞死，而應用自噬激活劑雷帕霉素可減少細胞壞死并減輕腦損傷，提示自噬具有神經元保護作用[14]。Koike等[15]在新生和成年小鼠缺氧缺血模型中發現，LC3-II蛋白水平顯著升高，電子顯微鏡顯示海馬錐體細胞層自噬體形成以及海馬神經元廣泛死亡，而Atg7基因缺陷小鼠的神經元死亡顯著減少，說明自噬參與了缺氧缺血導致的神經元損傷。而本實驗中Atg5蛋白水平顯著升高，干擾Atg5后小鼠腦梗死體積和水腫率顯著增加。結果的差異可能是由于實驗動物、缺血模型及對自噬的抑制靶點不同。

Atg5是參與自噬調控的重要基因，Atg5在自噬體形成前期參與形成了自噬共軛連接體Atg12～Atg5從而促進了自噬體膜結構的延伸和自噬體的形成。在酵母和哺乳動物中敲除Atg5基因能阻滯自噬進程[16]。也有研究對自噬基因Atg5缺陷鼠實施中樞神經系統缺血-缺氧實驗，與無基因缺陷鼠進行比較，結果顯示基因缺陷鼠不發生自噬并且大腦和小腦大部分皮質神經元死亡，說明Atg5可能通過調節自噬對神經元起保護作用[17]。我們的研究通過RNA干擾技術下調缺血小鼠腦內Atg5的表達，可以減輕MCAO后再灌注腦損傷。這是首次明確Atg5在小鼠再灌注腦損傷中的作用。

總之，我們的研究證實Atg5 siRNA可能通過抑制自噬而加重小鼠再灌注腦損傷。然而，由于缺血時間、部位以及干預時間窗的影響，自噬在腦缺血后神經元死亡中的作用仍需要進一步研究。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Knockdown of Atg5 aggravates cerebral ischemia and reperfusion injury in mice

PENG Zhi-feng1, WANG Xi-ying2, YANG Jing-hui1

(1DepartmentofPhysiology,2InstituteofMicroorganismandImmunology,SchoolofMedicine,ShanxiDatongUniversity,Datong037009,China.E-mail:pzf181@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To study the role of autophagy-related gene 5 (Atg5) in cerebral ischemia and reperfusion injury in mice. METHODS: BALB/c male mice (weighing 18～22 g) were randomly divided into sham group, ischemia/reperfusion (I/R) group, Atg5 siRNA group and control siRNA group. Focal cerebral ischemia was performed using the method of middle cerebral artery occlusion (MCAO) for 60 min and reperfusion for 24 h. In siRNA group and control group, 5 μL Atg5 siRNA or scrambled siRNA was administered by intracerebroventricular injection 24 h before MCAO. The expression of Atg5 at mRNA and protein levels in ischemic cortex at 24 h after reperfusion was determined by real-time PCR and Western blot. The infarct volume and edema were evaluated by TTC staining, and motor deficits were evaluated by neurological scoring. RESULTS: The expression of Atg5 at mRNA and protein levels was significantly increased 24 h after reperfusion in I/R group compared with sham group. Atg5 siRNA obviously decreased the expression of Atg5 at mRNA and protein levels induced by I/R. Inhibition of Atg5 exacerbated the infarct volume and ameliorated the neurological symptoms. CONCLUSION: Atg5 has neuroprotective effect on focal cerebral ischemia and reperfusion injury.

[KEY WORDS]Autophagy-related gene 5; Autophagy; Ischemia-reperfusion injury

[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0064- 05

[收稿日期]2015- 06- 25[修回日期] 2015- 10- 11

*[基金項目]山西大同大學博士科研啟動經費;山西省基礎研究項目(No.2015021178)

通訊作者△Tel: 0352-6205665; E-mail: pzf181@126.com

[中圖分類號]R363.1

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.011