鈣網織蛋白促進心臟瓣膜病患者心房重構

趙　飛，　王思博，　褚　鵬，　王　偉

(南京醫科大學第一附屬醫院胸外科，江蘇 南京 210029)

鈣網織蛋白促進心臟瓣膜病患者心房重構

趙飛，王思博，褚鵬，王偉△

(南京醫科大學第一附屬醫院胸外科，江蘇 南京 210029)

[摘要]目的： 明確鈣網織蛋白的異常表達與分布能否促進心臟瓣膜病患者心房重構的發生。方法: 從78位進行瓣膜置換手術的患者中獲得左右心房的標本。患者被分為竇性節律組、陣發性房顫組和持續性房顫組(房顫持續超過6個月)，檢測心房組織中鈣網織蛋白、整合素α5和轉化生長因子β1(TGF-β1)的蛋白表達情況。同時使用免疫共沉淀法測定鈣網織蛋白與鈣調磷酸酶B及整合素α5的結合情況。結果: 房顫組的鈣網織蛋白、整合素α5和TGF-β1的蛋白表達均高于竇性節律組，特別是在二尖瓣疾病患者的左心房中。免疫共沉淀顯示鈣網織蛋白可以與鈣調磷酸酶B和整合素α5結合產生相互作用。整合素α5的表達水平與TGF-β1的表達具有明顯相關性，鈣網織蛋白表達水平與整合素α5和TGF-β1的表達水平具有明顯的相關性。在相同心功能分級情況下，鈣網織蛋白的表達水平在持續性房顫組明顯高于竇性心律組。結論: 房顫患者心房組織中的鈣網織蛋白、整合素α5和TGF-β1表達增高，并與房顫類型有關，這提示鈣網織蛋白參與了心臟瓣膜病房顫患者的心房重構。

[關鍵詞]房顫； 鈣網織蛋白； 整合素α5； 轉化生長因子β1； 心房纖維化

心房纖顫(atrial fibrillation，AF)簡稱房顫，是臨床實踐中最常見的心律失常[1-2]。心臟瓣膜病(valvular heart disease，VHD)，包括二尖瓣或主動脈瓣病變均和房顫的發生密切相關。目前，瓣膜置換術是防止心瓣膜病患者發生心衰的較有效選擇[3-4]。房顫所致的電生理重構特別是組織結構重構將進一步加劇和維持房顫的發生發展，并且使得房顫持續發展從而進入不可逆轉的狀態[5]。相關研究表明，結構重構是房顫進一步發展的基礎[6-7]。心房纖維化則在心房結構重構中起著重要的作用[2, 8]，它引起心房組織內電傳導異常，產生局部折返激動和適合房顫持續發展的基礎[9]。然而，房顫中有關心房纖維化的確切機制仍未闡明。

最新研究表明，在組織的纖維化過程中鈣網織蛋白(calreticulin)的表達明顯增高，這提示鈣網織蛋白可增加細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的生成，這一過程在纖維化過程中起著重要的作用[10]。同時，鈣網織蛋白可誘導轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)表達，這一點在整個纖維化過程中也是至關重要[11]。TGF-β1和鈣網織蛋白均能直接或間接地誘導纖維蛋白、纖連蛋白等基質蛋白的表達[12]。我們研究了不同類型房顫的心瓣膜病患者心房組織中鈣網織蛋白、整合素α5(integrin-α5)和TGF-β1的表達和分布情況，以求明確鈣網織蛋白在房顫的病理性心房組織中表達是否增高以及心房心肌細胞中鈣網織蛋白是否與整合素α5和鈣調磷酸酶(calcineurin)B存在相互作用。另外，我們還進行了心房組織中鈣網織蛋白表達水平與TGF-β1、整合素α5表達水平之間以及TGF-β1表達水平與整合素α5表達水平之間的相關性分析。

材料和方法

1患者

選取2013年1月～2014年7月在南京醫科大學第一附屬醫院進行瓣膜置換手術的VHD患者78例，其中包含二尖瓣、主動脈瓣或雙瓣膜均有疾病的患者。根據患者術前情況將其分為3組：竇性心律(sinus rhythm，SR；n=30)組、陣發性房顫(paroxysmal AF,PaAF；n=16)組和持續性房顫(persistent AF,PeAF；n=32)組、除此之外選取10名竇性心律、接受了先天性心臟病手術的患者構成對照組(n=10)。我們選取術前右心房直徑無明顯差異的患者，收集了持續性房顫組的左、右心房組織和其它組的右心房組織。研究過程中排除以下4類患者：(1) 腎功能不全(血清肌酐 > 136 μmol/L)或II型糖尿病者；(2) 冠狀動脈造影和超聲心動圖評估示確診為冠心病的患者；(3) 70歲以上合并有相關增加房顫風險病史(如甲亢)者；(4) 術后嚴重并發癥需要特殊治療者。術前藥物(除華法令阻凝劑和血管緊張素轉化酶抑制劑外)需一直給藥到手術當天清晨。術前由一名研究員評估患者術前臨床特征；出院前由另一名研究員記錄詳細手術數據。該研究被南京醫科大學倫理委員會討論通過，所有受試者均簽署知情同意書。

2心肌組織采取和儲存

所有手術均由相同的心臟麻醉師、灌注師和手術團隊執行。在低溫(33～34 ℃)環境下對患者進行體外循環心臟手術，經灌注管順灌冷心停搏液，同時使用冰屑局部降溫，使心臟迅速停搏。冷心停搏液每20～30 min給予1次。在心臟手術體外循環開始之前，于腔靜脈置管處切取約250 mg右心耳組織以及從持續性房顫組患者中切取約250 mg左心耳組織。對于風濕性瓣膜病伴持續性房顫者來說，我科多常規行左心耳組織結扎和切除術，而對其它組患者來說則沒有必要進行左心耳切除，特別是對于竇性心律組。其中50 mg的左、右心耳組織固定于4%的多聚甲醛溶液中用以組織學和免疫組織化學的研究。剩余組織則快速冷凍于液氮中供后續研究所用。

3實驗方法

3.1蛋白免疫印跡(Western blot)實驗在組織提取的全過程中，使用含有50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)、150 mmol/L NaCl、 1% Na3VO4、1% Triton X-100和0.1% SDS的裂解緩沖液對心房組織樣本進行勻漿。用Lowry法檢測蛋白質濃度，分光光度計測量蛋白質吸光度(UV 2540)。變性樣本作如下處理：10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離含25 μg蛋白質的樣本，然后轉至NC膜上，5%的脫脂牛奶封閉薄膜上非特異抗原，然后加入抗鈣網織蛋白、整合素α5和TGF-β1的抗體4 °C下孵育過夜。將與 I 抗反應后的薄膜37 °C下置于含 II 抗(在含5%的脫脂牛奶和0.1%的Tween-20的PBS中稀釋羊抗兔IgG)的封閉液中反應2 h。染色后的薄膜用ECL試劑(GE Healthcare)進行化學發光檢測。每個結果近似的樣本至少重復3次Western blot操作。

3.2免疫沉淀法用抗鈣網織蛋白、抗calcineurin B和抗整合素α5抗體對心房組織樣本進行免疫共沉淀。樣本置于含有50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)、150 mmol/L NaCl、0.5% Na3O4和1% NP-40的裂解緩沖液中。免疫復合物通過A蛋白瓊脂糖滴(Beytime Biotechnology Inc.)捕捉。過量沖洗后，使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，進行Western blot操作。

3.3組織學和免疫組織化學觀察在pH 7.4的PBS液中，用4%的多聚甲醛固定左、右心耳組織24 h。乙醇脫水后石蠟包埋，切片。用V-G法染色2 μm厚的連續切片并在顯微鏡下觀察。另外在4 μm厚的石蠟組織切片上進行免疫反應對鈣網織蛋白的表達進行檢測。細胞或細胞膜棕染為陽性。

4統計學處理

采用GraphPad Prism Version 5.01對數據進行統計學處理。實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示。多組間(組數≥3)的差異用單因素方差分析(one-way ANOVA)法進行檢測。方差齊，則任意兩組總體均數間的差異用Scheffe法檢測；方差不齊，則任意兩組總體均數間的差異用Mann-WhitneyU法檢測。組間率的差異用Chi-square和Fisher exact檢驗確定。用Pearson相關分析來評估鈣網織蛋白、整合素α5和TGF-β1表達水平之間的關系。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1臨床特征和血液動力學數據

表1為術前血液動力學和超聲心動圖的相關數據，數據分析顯示持續性房顫組的左心房直徑明顯大于竇性心律組；另外，除對照組(先天性心臟病組)外，所有組的左心房直徑均大于右心房直徑。由于心房擴張將誘導相關蛋白表達促進心房纖維化，因此如果不去除此因素的影響將會干擾所檢測指標的分析。由于各組右心房直徑大小相似，心房擴張而影響心房組織重構的可能性將明顯降低,所以右心房組織較為適合用于研究房顫對心房組織重構的直接影響。在各組中右心室直徑、左室收縮末期尺寸和左室舒張末期尺寸并沒有明顯差異。

表1　各組臨床指標

LVDd: left ventricular end-diastolic dimension; LVDs: left ventricular end-systolic dimension; LAD: left atrium diameter; RAD: right atrium diameter; PeAF: persistent atrial fibrillation; PaAF: paroxysmal atrial fibrillation; SR: sinus rhythm; VHD: valvular heart disease; CHD: congenital heart disease; CPB: cardiopulmonary bypass.

2在房顫組中，心房組織中的鈣網織蛋白、整合素α5和TGF-β1蛋白的表達明顯增高

免疫組織化學檢查結果顯示：持續性房顫組左心房組織中的鈣網織蛋白表達水平高于右心房組織。鈣網織蛋白多存在于左心房組織中的胞膜和右心房組織中的胞質。房顫組的鈣網織蛋白表達水平高于竇性心律組和對照組，見圖1。Western blot結果表明，房顫組中鈣網織蛋白、整合素α5和TGF-β1的表達水平上調，特別是在持續性房顫組的左心房中上調更明顯，見圖2～4。

Figure 1.Immunohistochemistry for calreticulin (stained brown) in sections obtained from different groups (×400). Nuclei are in blue. Red arrows indicate a lot of calreticulin located on the myocyte membrane in left atrium in PeAF group. PeAF: persistent atrial fibrillation; PaAF: paroxysmal atrial fibrillation; SR: sinus rhythm; VHD: valvular heart disease; CHD: conge-nital heart disease; LA: left atrium; RA: right atrium.

圖1各組鈣網織蛋白的免疫組化結果

Figure 2.The protein expression of calreticulin in different groups. PeAF: persistent atrial fibrillation; PaAF: paroxysmal atrial fibrillation; SR: sinus rhythm; VHD: valvular heart disease; CHD: congenital heart disease; LA:left atrium; RA:right atrium. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsSR+VHD-RA;#P<0.05vsSR+CHD-RA.

圖2鈣網織蛋白在各組的表達

Figure 3.The protein expression of integrin-α5 in different groups. PeAF: persistent atrial fibrillation; PaAF: paroxysmal atrial fibrillation; SR: sinus rhythm; VHD: valvular heart disease; CHD: congenital heart disease; LA: left atrium; RA: right atrium. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsSR+VHD-RA and SR+CHD-RA;#P<0.05vsPeAF+VHD-RA and PaAF+VHD-RA.

圖3Integrin-α5蛋白在各組的表達

Figure 4.The protein expression of TGF-β1 in different groups. PeAF: persistent atrial fibrillation; PaAF: paroxysmal atrial fibrillation; SR: sinus rhythm; VHD: valvular heart disease; CHD: congenital heart disease; LA: left atrium; RA: right atrium. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsSR+VHD-RA;#P<0.05vsSR+CHD-RA;△P<0.05vsPeAF+VHD-RA and PaAF+VHD-RA.

圖4TGF-β1蛋白在各組的表達

3鈣網織蛋白、整合素α5和TGF-β1的蛋白表達水平之間密切相關

Western blot法檢測發現，鈣網織蛋白和整合素α5的蛋白質表達水平之間、鈣網織蛋白和TGF-β1的蛋白質表達水平之間、整合素α5和TGF-β1的蛋白質表達水平之間均有明顯統計學相關性，見圖5～7。

4鈣網織蛋白表達水平與NYHA心功能分級之間的關系

Western blot法檢測結果顯示，房顫組中NYHA分級III級的患者其左、右心房中鈣網織蛋白的蛋白表達水平高于NYHA II級的患者。在同一組患者中，僅當患者處于NYHA III級時，左心房鈣網織蛋白的表達水平高于右心房組織，而當患者處于NYHA II級時，左心房鈣網織蛋白的表達水平與右心房表達水平沒有明顯差異。在NYHA分級相同患者的右心房組織中，房顫組的鈣網織蛋白的表達水平高于竇性心律組。另外，房顫組的左心房組織中的鈣網織蛋白表達水平明顯高于竇性心律組的右心房組織，見表2。

5鈣網織蛋白與整合素α5和calcineurin B之間的相互作用

免疫共沉淀分析表明，持續性房顫患者左、右心房組織中鈣網織蛋白與整合素α5和calcineurin B 之間存在著相互作用，見圖8。

Figure 5.The relationship between protein expression of calreticulin and integrin-α5.

圖5鈣網織蛋白與integrin-α5的相關性分析

Figure 6.The relationship between protein expression of calreticulin and TGF-β1.

圖6鈣網織蛋白與TGF-β1的相關性分析

Figure 7.The relationship between protein expression of integrin-α5 and TGF-β1.

圖7Integrin-α5與TGF-β1的相關性分析

討論

大量研究表明，心房結構重構為房顫的發生提供了基礎，維持了房顫的發生發展[13]。影響心房結構重構的相關因素已被大多數學者所確認；其中，心房纖維化和心肌肥大在結構重構中扮演著關鍵的角色[14]。心肌纖維化是以心肌間質成纖維細胞大量增生、細胞外基質蛋白異常堆積為特征的心臟病理性變化[15]。這些變化可能導致心肌細胞內電傳導延遲，產生異常傳導通路；同時也會導致異位興奮的產生，進而形成折返回路[16]。

表2　對不同心臟功能鈣網織蛋白表達的分析

**P<0.01vsNYHA II;##P<0.01vsleft atrium;△△P<0.01vssinus rhythm.

Figure 8.Calreticulin-specific antibody, calcineurin B/integrin-α5-specific antibody and control IgG were used for immunoprecipita-tion, and immunoblots showed that both calcineurin B and integrin-α5 co-immunoprecipitated with calreticulin.

圖8鈣網織蛋白分別與calcineurin B和integrin-α5的免疫共沉淀實驗

鈣網織蛋白是一種內質網上的鈣結合蛋白，在心臟發育中發揮重要作用[17]。鈣網織蛋白可分布于細胞內、細胞膜表面和細胞外間隔[18]。許多哺乳動物細胞表面均表達鈣網織蛋白，這證明這種細胞內分子的作用不僅限于內質網內，它可以在內質網外對細胞產生作用[19-21]。有報道稱，外源性鈣網織蛋白可刺激成纖維細胞遷移[22]，并上調整合素的表達。細胞外基質中表達的鈣網織蛋白可改變自身結構從而作為重要的介導分子連接細胞外基質和心肌細胞，刺激心肌細胞發生重構[23-24]。正常人的心肌表達低水平的鈣網織蛋白，鈣網織蛋白的過度表達常見于高血壓、心衰等疾病，這是心肌細胞內幼稚基因被重新激活的表現[25]。我們發現持續性房顫組NYHA III級患者的鈣網織蛋白表達水平明顯高于II級患者，在竇性心律組中這種差別無統計學意義。而在NYHA心功能分級相同的患者中，房顫組鈣網織蛋白的表達水平明顯高于竇性心律組。因此，我們認為房顫和心衰均可激活鈣網織蛋白的過度表達，且房顫通過激活鈣網織蛋白的過度表達誘導心房重構的能力大于心衰。我們證明了在竇性心律組相對正常的心房組織中鈣網織蛋白的表達水平較低，這在先心病對照組中低表達的現象更為明顯。

當細胞黏附于細胞外基質時，鈣網織蛋白和整合素相互結合[26]，從而使基質金屬蛋白酶2、基質金屬蛋白酶9和膜型基質金屬蛋白酶1的表達水平明顯增高[24]。鈣網織蛋白作為伴隨分子保證了整合素的正確折疊[27]。整合素是聯系細胞外基質和心肌細胞的基本單位[28]。同時，整合素可活化TGF-β1(一種心臟纖維化過程中的重要細胞因子)[29]。TGF-β1是血管緊張素II的主要下游調節介質[2]，在心臟纖維化信號通路中起著關鍵作用[30]。TGF-β1刺激成纖維細胞表達更多的整合素[31]，而整合素的過度表達反過來也會促進TGF-β1的表達[32]。通過免疫共沉淀反應，我們發現鈣網織蛋白和整合素α5相互作用，我們推測房顫患者左、右心房組織中鈣網織蛋白過度表達進而誘導大量整合素的活化。我們證明了鈣網織蛋白和TGF-β1、鈣網織蛋白和整合素α5、整合素α5和TGF-β1之間具有明顯的相關性。

心房肥大阻礙心房組織間的電傳導，導致異位電活動及傳導彌散，進一步可促進房顫的發生和發展。在導致心房病理性肥大多個信號通路中，Ca2+-calcineurin-nuclear factor系統被確認為關鍵性節點[33]。鈣網織蛋白被認為是calcineurin的上游調節因子[34]。同樣，通過免疫共沉淀，我們發現鈣網織蛋白和calcineurin B的相互作用。我們推測房顫患者左、右心房組織中鈣網織蛋白誘導了Ca2+-calcineurin-nuclear factor系統的活化。

綜上所述，我們發現在房顫患者心房組織中，鈣網織蛋白、整合素α5和TGF-β1參與了房顫患者的心房重構。但是，由于導致房顫的病因諸多，故鈣網織蛋白在心房結構重構和電生理重構中的相關機制還有待進一步的研究。

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(責任編輯： 盧萍， 羅森)

Over-expressed calreticulin interacts with integrin-α5 and calcineurin system to induce atrial remodeling in patients with atrial fibrillation and valvular disease

ZHAO Fei, WANG Si-bo, CHU Peng, WANG Wei

(DepartmentofThoracicSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China.E-mail:wangwei-doctor@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To determine whether calreticulin over-expression contributes to atrial fibrosis in the patients with atrial fibrillation (AF) and valvular heart disease (VHD).METHODS: Right and left atrial specimens were obtained from 78 patients undergoing valve replacement surgery. The patients were divided into sinus rhythm (SR) group, paroxysmal AF (PaAF) group and persistent AF (PeAF, AF lasting >6 months) group. The protein expression of calreticulin, integrin-α5, and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) was measured. Immunoprecipitation was also performed to determine whether calreticulin interacted with either calcineurin B or integrin-α5. RESULTS: The protein expression of calreticulin, integrin-α5 and TGF-β1 was increased in AF groups, especially in the left atrium of the patients with mitral valve disease as compared with SR group. Calreticulin interacted with both calcineurin B and integrin-α5. The expression level of integrin-α5 was significantly correlated with the expression level of TGF-β1, while the expression level of calreticulin was correlated with that of integrin-α5 and TGF-β1. Under similar classification of the cardiac function, the expression level of calreticulin in PeAF group was higher than that in SR group. CONCLUSION: The expression of calreticulin, integrin-α5, and TGF-β1 is increased in the atrial tissues of the AF patients and is related to the AF type, suggesting that calreticulin is involved in atrial remodeling in AF and VHD patients.

[KEY WORDS]Atrial fibrillation; Calreticulin; Integrin-α5; Transforming growth factor-β1; Atrial fibrosis

[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0033- 08

[收稿日期]2015- 06- 08[修回日期] 2015- 09- 30

通訊作者△Tel: 025-68136049； E-mail: wangwei-doctor@163.com

[中圖分類號]R541.7+5; R363.2

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.006