水質中葉綠素a檢測方法的改進和探討

李　征，胡新躍.北京市豐臺區環境保護局，北京　0007 .北京市朝陽區環境保護局，北京　005

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水質中葉綠素a檢測方法的改進和探討

李征1，胡新躍2
1.北京市豐臺區環境保護局，北京100071 2.北京市朝陽區環境保護局，北京100125

摘要葉綠素a是地表水監測的常規項目，是水體初級生產力的重要指標。目前實驗室主要采用國家環保總部《環境監測技術規范》（第四冊）中規定的分光光度法測定葉綠素a，在大量的實際研究工作中發現，分光光度法測量葉綠素a存在一定的缺陷。缺陷主要表現在葉綠素的提取過程中，為此我們將對原有方法進行改進。本文通過對規范方法與改進的浸提方法和超聲法等進行實驗比對，找出穩定性好，結果準確，操作簡單同時又能減少丙酮對操作者毒害作用的方法。

關鍵詞葉綠素a的提取；監測方法；方法比較與改進

目前，通過生物學指標監控河湖污染情況漸成趨勢，其中浮游植物是一項重要的研究對象。由于葉綠體是浮游植物的重要功能器官，其功能的強弱及其時空的動態變化，是通過葉綠素的光合作用實現的。因此，目前對葉綠素a的監測是了解水質污染狀況及其動態特征的有效方法。

按照北京市環境保護局的要求，自2007年起筆者就開始對朝陽區轄區內的湖泊（主要包括朝陽公園的水碓湖、紅領巾公園湖和奧林匹克公園湖）進行葉綠素a的測定，以評價這些湖泊的富營養化程度。2012年帶領豐臺監測站取得了葉綠素a檢測的資質，檢測過程中積累了一些經驗，同時在監測過程中也發現了許多問題。為了提高葉綠素a監測的準確性，簡化檢測操作程序，保證檢測人員身體健康，我們對現有的監測方法進行了嘗試性地改進。

1　現階段葉綠素a檢測情況概述

目前，測定葉綠素a沒有國標方法。現在環保系統采用的葉綠素a監測方法主要依據是《水和廢水監測分析方法（第四版）》中的水質葉綠素a的測定的分光光度法。該方法測定葉綠素a的基本原理是：通過抽濾的方法將附著在濾膜上的藻類，溶解在90%的丙酮溶劑中，以反復研磨和離心的方法提取葉綠素a。該方法的優點是能充分將藻類植物的細胞壁破碎，對葉綠素的提取速度較快。

在實際檢測中我們發現，該方法的主要缺點在于研磨過程中葉綠素a容易發生光降解，同時因為反復轉移操作及易產生損失，使結果偏低、誤差較大，此外研磨過程中操作人員與丙酮接觸時間長，不利于操作人員的健康。

為此我們主要從溶劑、提取方式、溫度和時間控制等方面對原有方法進行改進。本文通過對規范方法與改進的浸提方法和超聲法等進行實驗比對，找出穩定性好，結果準確，操作最為簡單的方法。

2　分光光度法測葉綠素a步驟及問題

2.1實驗材料

地表水水樣（每次量取100ml）。

儀器設備：722S分光光度計、真空泵、玻璃抽濾器、TDZ5-W5多管架自動平衡離心機、孔徑0.45μm乙酸纖維濾膜、電動玻璃勻漿機、無水碳酸鎂粉末、90%丙酮。

2.2常規實驗操作方法

1）水樣抽濾：在抽濾器上裝好0.45μm的乙酸纖維濾膜。倒入100ml的水樣進行抽濾，水樣抽完后，繼續抽1min～2min，以減少濾膜上的水分。

2）樣品提取：將帶有浮游植物的濾膜取出放在冰箱內低溫干燥6h～8h后放入組織研磨器中，加入少量無水碳酸鎂粉末及2m1～3m1的90%的丙酮，充分研磨，提取葉綠素a。用離心機在3 000r轉速下離心lOmin。將上清液倒入lOml容量瓶中。之后將剩余固形物倒入組織研磨器中，用2m1～3ml的90%的丙酮，繼續研磨提取，離心lOmin，并將上清液再轉入容量瓶中。重復1～2次，用90%的丙酮定容為lOml，搖勻。

3）測定：用1cm光程的比色皿，分別讀取750nm，663nm，645nm，630nm波長的吸光度，并以90%的丙酮作空白吸光度測定，對樣品吸光度進行校正［1］。

2.3葉綠素a監測方法目前存在的問題

1）操作誤差：由于操作過程中反復轉移樣品，樣品比較粘稠，容易產生較大的人為操作誤差。同時由于葉綠素a對光照及溫度敏感，在研磨過程中摩擦生熱也會造成一定的葉綠素損失。

2）安全性。由于丙酮揮發性大，有神經毒性，對操作人員身體健康有損害。組織研磨器是玻璃制品，在操作過程中易發生破碎，有安全隱患。

3　葉綠素a不同改進方法的比較

3.1反復凍融-浸提法

抽濾步驟和比色步驟與規范法相同，將研磨步驟改為將過濾水樣后的濾膜裝進黑色塑料袋，于-20℃冰箱和室溫下反復凍融3～5次，再放進盛有10ml丙酮（90%）的離心管中振搖1min后，于4℃冰箱浸提20h，浸提過程需振搖1～2次［2］。實驗結果見表1。

表1 研磨法與反復凍融-浸提法對比實驗結果

從表1中可以看出，采用反復凍融-浸提法所得的葉綠素a平均值明顯高于研磨法，兩者之間存在明顯差異。且研磨法平行樣的標準偏差較大，主要是受人為因素影響，浸提法減少了研磨和轉移過程中葉綠素a的損耗，人為誤差小，穩定性好。

3.2超聲波提取方法

抽濾步驟和比色步驟與規范法相同，將研磨步驟改為直接將加了碳酸鎂粉末的濾膜碎片置于離心管中，加入90%丙酮，將離心管用黑色塑料袋包裹后超聲破碎10min，振蕩器振搖（300r/min）萃取1h，離心機（10 000r/min）離心10min，之后將上清液轉入10ml棕色容量瓶中，用90%丙酮定容至10ml，搖勻待測［3］。實驗結果見表2。

表2　超聲法與研磨法提取結果比較

實驗結果表明，與傳統的研磨法相比較，超聲法測定葉綠素a的提取效率優于研磨法。

3.3乙醇替代提取液法

由于丙酮具有神經毒性，對操作人員的身體健康有毒害作用，因此，在操作過程中嘗試用安全的乙醇替代丙酮進行提取。實驗方法是將抽濾后的干燥濾膜在乙醇溶液中浸泡過夜，在進行研磨提取和離心提取部分，實驗結果見表3。

表3　乙醇替代提取液丙酮法對比實驗結果

從表3中可以看出，在浸泡提取一天之后，乙醇的提取能力接近丙酮的提取效果，可以考慮乙醇替代丙酮溶劑，增加浸泡提取時間。

4　結論

1）通過上面實驗比較可以看出，規范操作法由于研磨過程中樣品容易損失導致實驗結果偏低，應進一步進行改進。

2）超聲法測定葉綠素a的提取效率優于丙酮—研磨法，且操作簡便，節省時間，效率高，重復性好，有可比性，安全性優，保障健康，能減少系統操作誤差。

3）反復凍融-浸提法在操作更為簡單，提取效率主要通過反復凍融對胞壁的破壞和浸提時間的延長來實現，該方法大大減少了操作者與丙酮的接觸時間，降低了丙酮的毒害作用，同時具有較好的穩定性。

4）用乙醇替代丙酮溶液，雖然提取效果比丙酮溶劑略遜，但是可以通過增加浸提時間來減少差距，總體來講乙醇具備替代丙酮作為提取溶劑的條件，但要在方法上做更多改進來提高乙醇的提取效率。

參考文獻

［l］國家環境保護總局.水和廢水監測分析方法.北京：中國環境科學出版社.

［2］劉秀麗，宋平，孫成明.植物葉綠素測定方法的再探討［J］.江蘇農業研究，1999（3）：46-47.

［3］吳志旭，張雅燕.2002.浮游植物體內葉綠素a測定方法的改進［J］.化學分析計量，2002，11（6）：37-38.

中圖分類號X3

文獻標識碼A

文章編號1674-6708（2016）165-0217-02

作者簡介：李征，北京市豐臺區環境保護局。胡新躍，北京市朝陽區環境保護局。