廣藿香香葉醇合酶基因克隆及表達分析

歐陽蒲月,曾少華，莫小路*

(1 廣東食品藥品職業學院,廣州 510520；2 中國科學院華南植物園,廣州 510650)

廣藿香香葉醇合酶基因克隆及表達分析

歐陽蒲月1,曾少華2，莫小路1*

(1 廣東食品藥品職業學院,廣州 510520；2 中國科學院華南植物園,廣州 510650)

摘要:香葉醇合酶(geraniol synthase，GES)是香葉醇形成過程中非常重要的酶，是萜類代謝途徑的限速酶。根據課題組廣藿香轉錄組數據中的GES 轉錄本序列設計基因全長擴增引物，采用RT-PCR方法克隆了廣藿香GES基因的全長cDNA序列。對該基因進行了相關的生物信息學分析，并利用熒光實時定量PCR法檢測了PcGES1基因在4個廣藿香栽培種中不同時期莖、葉中的表達情況。結果顯示：廣藿香GES基因包含一個完整的ORF框，長1 734 bp，編碼577個氨基酸，命名為PcGES1,GenBank登錄號為KF926075 ；PcGES1基因編碼的氨基酸序列與羅勒GES基因編碼的氨基酸序列最為相近。廣藿香GES蛋白定位在葉綠體中，無跨膜區域。PcGES1主要在葉中表達，老葉中表達量最高；從不同栽培種來看，PcGES1在石牌廣藿香和高要廣藿香中表達模式相似，在海南廣藿香與印尼廣藿香中表達相似，在海南廣藿香老葉中表達最高。該研究結果為進一步闡明廣藿香萜類代謝途徑奠定了基礎。

關鍵詞:廣藿香；香葉醇合酶；萜類合成

香葉醇合酶(geraniol synthase，GES)是香葉醇形成過程中非常重要的酶，是環烯醚萜類成分合成途徑的限速酶。2007年，以色列科學家向西紅柿中成功地導入了一種檸檬羅勒基因，該基因能夠制造一種香葉醇合酶，從而使西紅柿產生類似檸檬的芳香氣味，花果香味的新型轉基因西紅柿誕生了。目前，香葉醇合酶基因的研究已經被越來越多的科學家們所關注[1]。香葉醇是大多數藥用植物、香料植物產生香味的主要化學成分。前體物質geranyl diphosphate (GDP)在香葉醇合酶的作用下生成香葉醇的中間體，進而生成了香葉醇[1-2](圖1)。目前，在唇形科羅勒屬植物[3-4]、紫蘇屬植物[5]，樟科細毛樟[6]、夾竹桃科長春花[7]、敗醬科纈草與馬鞭草科甜舌草[8]中展開了香葉醇合酶的研究。

廣藿香[Pogostemoncablin(Blanco) Benth]為唇形科刺蕊草屬植物，以全草入藥[9]，是“藿香正氣軟膠囊”、“藿香正氣丸(水)”、“保濟丸”等中成藥以及香料/化妝品等商品的主要原料。

廣藿香的主要化學成分為揮發油，屬萜類化合物[10-11]。廣藿香作為一個自然分類群屬于亞洲熱帶種，原產東南亞菲律賓、馬來西亞等國。然自宋代從南洋傳入中國嶺南地區(今廣東)后，經過長期人工栽培，在中國各地引種的廣藿香形態上雖有一些變異，但干燥藥材差別不明顯，采用傳統的形態組織學方法難以區分種內的分化類型，且各地廣藿香含油量有所差異。廣藿香目前存在4個栽培種：石牌廣藿香、高要廣藿香、海南廣藿香和原產地的印尼廣藿香。文獻報道廣藿香揮發油化學組成與產地分布、種植和采收季節有關；廣藿香按其揮發油的成分可分為兩種類型：即酮型廣藿香(石牌廣藿香與高要廣藿香)和醇型廣藿香(海南廣藿香與原產地的印尼廣藿香),并認為廣藿香存在產地及揮發油成分不同的分化類型，是適應特定環境的結果，其本質上由遺傳變異所決定[12]。

圖1　香葉醇的形成過程[1-2]Fig. 1　Synthesis process of geraniol[1-2]

為探索廣藿香各栽培品種間的遺傳差異與其揮發油成分之間的關系，本實驗基于廣藿香的轉錄組數據分析，對廣藿香萜類代謝途徑中的香葉醇合酶進行基因克隆和表達分析研究。

1材料和方法

1.1材料

4個廣霍香栽培種石牌廣霍香、高要廣霍香、海南廣霍香和印尼廣霍香種植于廣東省中藥研究所嶺南中藥園。選取海南廣藿香[P.cablin(Blanco) Benth. cv.hainangensis]葉，迅速放入裝有液氮的保溫瓶中，后置于-75℃冰箱保存備用。本材料經廣東省中藥研究所蔡岳文老師鑒定。DH-5α感受態細胞由本實驗室保存。

1.2方法

1.2.1RNA提取取-75 ℃保存的葉，在180～200 ℃烘烤過的研缽中用液氮將其充分研磨，迅速倒入DEPC處理過的離心管中，待液氮揮發后，按100 mg材料1 mL 試劑的比例加入適量Trizol，下面的步驟按說明書(Tiangen DP421)進行。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質量，并用紫外分光光度計(Nanodrop 2000c)測定總RNA濃度和純度。

1.2.2cDNA合成初始反應體系：Oligo dT(20 pmol/μL，廣州凱基生物有限公司)2 μL；RNA 10 μL；dNTPmix(25 μmol/L)2 μL；RNase-free ddH2O 12 μL。將反應體系于65 ℃變性5 min，取出后置于冰上1 min以上，向初始反應體系中加入下列試劑：5×first-strand buffer 8 μL；0.1 μmol/L DTT 4 μL；Superscript Ⅲ反轉錄酶(200 u/μL，Life公司)2 μL；H2O 2 μL。再將總反應體系于42 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min,于PCR儀上進行第一鏈cDNA合成。反轉錄產物cDNA可在-20 ℃保存。

1.2.3基因克隆根據廣藿香轉錄組中長為1 591 bp Unigene10850序列，利用ORF閱讀框預測其含有一個完整的開放閱讀框，并利用Primer3在線設計正向引物GES1-F(5’- AATTAAACTACCAAACAACATTA -3’)和 反向引物GES1-R(5’-AGTTTTTATGTACAAATCCACGCAT-3’)。PCR反應體系：3 μL第一鏈cDNA(反轉錄產物稀釋10倍)為模板； 2.5 μL LA PCR buffer；2 μL正向及反向特異引物(10 mmol/L，上海生工生物工程技術服務有限公司合成)；0.25 μL LATaqDNA聚合酶(日本寶生物有限公司)；用無菌去離子水將體系補至25 μL。PCR反應條件：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。結果檢測：取PCR 產物5 μL，用1%瓊脂糖電泳檢測。將上述PCR產物割膠，使用凝膠回收試劑盒(日本寶生物有限公司)過柱回收。回收程序依據試劑盒說明書進行。各取4.5 μL回收產物，克隆到pMD19-T載體(日本寶生物有限公司)過夜連接。將連接產物轉入DH-5α感受態細胞，經涂布培養，在氯芐抗性平板上進行陽性克隆篩選，各取4～8個進行菌液PCR驗證，后各取2個陽性克隆進行雙向測序(廣州中美泰和生物技術有限公司)。

1.2.4序列的生物信息學分析先將所測得的序列在NCBI 數據庫中進行Blast 搜索，初步確定這些基因的類別。使用ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)進行開放閱讀框預測，再進行PcGES基因的一系列分析。其編碼蛋白的理化性質預測采用ExPASy Proteomics Server提供的在線工具Protparam (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)；PcGES蛋白質結構搜索分別采用在線工具ExPASy PROSITE (http://www.expasy.ch/prosite/)和美國國立生物技術信息中心(NCBI)在線工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)。在線HMMOTOP (http://www.enzim.hu/hmmtop/html/adv_submit.html)進行跨膜區預測；在線分析氨基酸序列/疏水性分析(http://web.expasy.org/protscale)；用HMMTOP(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)檢測跨膜結構；使用SignalP4.0Server進行分泌蛋白預測(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；利用WOLFPSORT (http://wolfpsort.org/) 進行蛋白定位信號預測，使用InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)進行蛋白保守結構域搜索。采用MEGA6.06軟件內置的NJ法構建進化樹。所有軟件如無特殊說明，均采用默認參數。

1.2.5PcGES1基因表達分析取廣藿香4個栽培種的嫩葉、成熟葉、老葉、嫩莖、成熟莖和老莖等組織，同上方法提取各組織總RNA 1 μg，使用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser (Takara) 進行DNA消化和反轉錄得到cDNA 第一鏈，并且將cDNA 原液稀釋10倍作為qPCR的模板。以actin(ACT)基因作為內參，參考SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Takara)說明書(日本寶生物有限公司)設計引物:PcACT基因上游引物5-GCTCCTAGCAGCATGAAGATCA-3，下游引物5-AGCATCAGCAGACAGCAATCAT-3；PcGES1基因上游引物5-GGAAGGATTTGAATGGGGAG-3，下游引物5-TGCTTGTACACCACTTGGGA-3。qPCR反應在羅氏lightcycle480定量PCR儀上完成。反應體系20 μL：SYBR premix Ex Taq Ⅱ(2x)10 μL, 正反引物各0.8 μL，cDNA模板2 μL，H2O 6.4 μL。qPCR 反應程序采用兩步法：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸34 s，循環數40；反應結束后繼續運行溶解曲線程序，以確保目的產物的特異擴增。以Actin作為內參，使用2ΔΔCt方法來確定基因相對表達量，其中參照物表達量定為“1”[13]，表達數據運用SigmaPlot10.0進行分析。

2結果與分析

2.1廣藿香PcGES1基因的克隆

以海南廣藿香總RNA為模板進行逆轉錄獲得cDNA序列，利用RT-PCR擴增得到1條1 800 bp左右的條帶，對于擴增所得條帶進行回收、連接、轉化、陽性克隆檢測和測序后獲得1條1 828 bp的正確序列，利用NCBI的ORF Finder預測該序列含有一個完整的開放總計框，長1 734 bp，編碼577個氨基酸(圖2)。將該基因命名為PcGES1，GenBank登錄號為KF926075。

2.2PcGES1基因編碼蛋白特性分析

PcGES1基因預測編碼577個氨基酸，利用ExPASy Proteomics Server提供的在線工具Protparam對其編碼蛋白的理化性質進行預測分析。推測PcGES1的分子式為C3006H4727N791O868S24，分子量為66.61 kD，等電點為5.88；帶負電殘基(Asp+Glu)為79，正電殘基(Arg+Lys)為73。該蛋白的不穩定系數為54.35，脂肪系數為95.01，親水性系數為-0.257。在線SignalP4.0 Server 軟件分析結果表明PcGES1為非分泌蛋白。WOLFPSORT預測表明PcGES1定位在葉綠體中(chlo: 12.0, cyto: 1.0)。用HMMTOP預測PcGES1無跨膜區域。應用protscale對PcGES1蛋白的氨基酸序列/疏水性預測分析結果表明，PcGES1多肽鏈第437位的亮氨酸具有最高的分值2.700，疏水性最強；第505位的谷氨酸具有最低的分值-2.833，親水性最強。整個來看，其親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，為親水蛋白。使用InterProScan進行蛋白保守結構域搜索，發現其主要有2個保守結構域，第63～260為一個結構域，這個區域為萜類環化酶/α-α環-異戊烯基轉移酶蛋白域，也是萜類合酶， N末端區域；第249～574為另一個結構域，主要為類異戊二烯合酶域與萜類合酶金屬結合域(圖3)。

圖2　PcGES1基因的全長cDNA及推衍的氨基酸序列Fig. 2　The full-length cDNA and deduced amino acid sequence of PcGES1

圖3　利用InterProScan分析PcGES1蛋白的保守結構域Fig. 3　Analysis of PcGES1 conserved domains using InterProScan

2.3PcGES1編碼蛋白的系統進化樹分析

從GenBank蛋白質數據庫搜索發現，目前，已公布的植物GES基因并不多。從NCBI非冗余蛋白數據庫(Nr)中選取與PcGES1基因編碼蛋白相似性較高的6條蛋白序列，采用MEGA6.06軟件,用其內置NJ法構建進化樹。結果(圖4)表明，廣藿香PcGES1基因編碼的氨基酸序列與羅勒(Ocimumbasilicum，Q6USK1.1)GES編碼的氨基酸序列聚在一起，再與油橄欖(Oleaeuropaea，AFS59975.1,AFI47926.1)、長春花(Catharanthusroseus,AFD64744.1)GES編碼的氨基酸序列聚在一起。

S. 石牌廣藿香； G. 高要廣藿香； H. 海南廣藿香； Y. 印尼廣藿香 圖5　PcGES1基因在廣藿香4個栽培種中的時空表達量P. cablin (Blanco) Benth. cv. shipaiensis； G. P. cablin (Blanco) Benth.cv. gaoyaoensis； H . P. cablin (Blanco) Benth. cv. hainangensis；Y.P. cablin (Blanco) BenthFig. 5　Spatiotemporal expression profile of PcGES1 in four P. cablin(Blanco) Benth cultivars

2.4PcGES1的表達分析

利用實時定量PCR方法對PcGES1進行基因分析。結果表明：PcGES1在廣藿香的不同栽培種、同一栽培種不同部位或不同時期均存在差異表達(圖5)。從不同栽培種來看，PcGES1在海南廣藿香中表達量最高，在印尼廣藿香中表達較高，在高要廣藿香的表達較低，在石牌廣藿香中的表達最低；從不同組織來看，PcGES1在葉中的表達量遠遠高于莖，莖的表達量非常低，基本不表達；從不同發育時期來看，PcGES1在老葉中的表達量最高，比成熟葉與嫩葉高很多。

3討論

GES基因是萜類代謝中環烯醚萜苷類成分合成途徑的限速酶，前體物質GDP在香葉醇合酶(GES基因)的作用下形成了香葉醇。香葉醇是大多數香料植物產生香味的主要化學成分。目前，GES基因表達研究涉及的植物很少，僅在細毛樟[6]中進行了較詳細的研究，其結果表明，細毛樟具有3種不同化學型。通過對3種不同化學型細毛樟GES基因表達模式研究發現，不同化學型的基因表達也不同，導致香葉醇主成分CtGerS在香葉醇化學型葉片中有明顯表達，而在其余2個化學型只有較低表達量，此結果將化學型主成分的不同與形成主成分的基因直接聯系起來。本研究立足于實驗室所建立的廣藿香高通量轉錄組測序數據，從中克隆到的1條GES基因，其與羅勒的GES基因一致性最高。從實時定量PCR分析結果來看，PcGES1基因主要在葉中表達，且在高要廣藿香、海南廣藿香、印尼廣藿香老葉中表達量最高，而在莖中的表達較低。對廣藿香植株不同部位化學成分含量的分析結果表明，葉的揮發油含量最高[14-16]，因此，PcGES1表達可能與揮發油的合成有關。已有研究[17]表明，成熟廣藿香植株的葉中PTS基因表達量明顯高于莖和根,莖略高于根,但差異不顯著,即在成熟廣藿香植株中,廣藿香醇合成酶在葉中活性最高，葉是萜類成分基因表達的主要部位。本研究中，PcGES1在海南廣藿香、印尼廣藿香中表達量均比較高，而在高要廣藿香、石牌廣藿香中的表達量均較低，顯示了PcGES1的表達與廣藿香的物種屬性有關[18-19]。PcGES1在高要廣藿香、石牌廣藿香中表達量都不高，但有意思的是，PcGES1在石牌廣藿香中表達量最高的部位是較成熟的葉片，與其它3個栽培種存在明顯差異，PcGES1的這種表達差異可能是導致石牌廣藿香與其它3個栽培種揮發油成分差異的原因之一。本研究結果為萜類化合物生物合成的分子機制探究提供了新思路。

圖中分支上的數字表示bootstrap驗證中基于1 000次重復該節點可信度的百分比；標尺代表遺傳距離；括號內編號為氨基酸登錄號圖4　PcGES1與其它植物GES編碼氨基酸序列系統發育樹The numbers on the branches represent the reliability percent of bootstrap values based on 1 000 replications; The scale bar represents genetic distance; The accession No. is given in bracketFig. 4　Phylogenetic tree of amino acid sequences of GES1 between P. cablin(Blanco) Benth. and other plants

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(編輯:宋亞珍)

Clone and Expression Analysis of Geraniol Synthase Gene

inPogostemoncablin

OUYANG Puyue1, ZENG Shaohua2, MO Xiaolu1*

(1 Guangdong Food and Drug Vocational College, Guangzhou 510520, China; 2 South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China)

Abstract:Geraniol synthase (GES), which is very important to the biosynthesis of geraniol, is one of the key enzymes in terpenoids pathways. Based on the transcriptome analysis of P.cablin, one unique sequence encoding GES was discovered and the primers for PCR were designed from it, the full-length GES cDNA was cloned using RT-PCR strategy and its bioinformatics analysis has been done. Gene expression profile of PcGES1 in leaves and stems of different development stages of four cultivars was evaluated using quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). The results showed that the gene GES in P.cablin, named as PcGES1, accession number KF926075 in GenBank, contains a 1 734bp open reading frame and encodes a predicted protein of 577 amino acids. Phylogenetic analysis indicated that the amino acids encoded by GES1 of P. cablin were closest to that of Ocimum basilicum. PcGES protein was located in chloroplast, no transmembrane district. qRT-PCR analysis indicated that PcGES1 mainly expressed in leaves, and the highest expression was in old leaves. The expression pattern analysis of PcGES1 among four cultivars indicated that the expression pattern of P. cablin (Blanco) Benth. cv. shipaiensis

was similar toP.cablin(Blanco) Benth. cv.gaoyaoensis, while that ofP.cablin(Blanco) Benth. cv.hainangensiswas similar toP.cablin(Blanco) Benth. This study provided a foundation for exploring the mechanism of terpenoid biosynthesis inP.cablinplants.

Key words:Pogostemon cablin; geraniol synthase; terpenoids synthesis

文章編號:1000-4025(2016)05-0896-06

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.05.0896

收稿日期:2016-01-24;修改稿收到日期:2016-05-06

基金項目:廣東省科技計劃項目(2015A040404029)；廣東食品藥品職業學院自然科學研究項目(2015YZ007)

作者簡介:歐陽蒲月(1978-)，女，碩士，副教授，研究方向：藥用植物分子生物學。E-mail：ouyangpy@gdyzy.edu.cn *通信作者:莫小路，教授，研究方向：藥用植物生物技術。E-mail：moxl@gdyzy.edu.cn

中圖分類號:Q785；Q786

文獻標志碼:A