糧用豌豆組織培養(yǎng)及植株再生條件優(yōu)化

劉 慧，趙依詩(shī)，吳 晨，張少斌＊

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院遼寧沈陽(yáng)110866；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866）

糧用豌豆組織培養(yǎng)及植株再生條件優(yōu)化

劉 慧1，趙依詩(shī)2，吳 晨2，張少斌2＊

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院遼寧沈陽(yáng)110866；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866）

為了豌豆遺傳轉(zhuǎn)化及優(yōu)良品種快速繁殖提供借鑒，進(jìn)行了豌豆組織培養(yǎng)及植株再生條件試驗(yàn)。結(jié)果表明：豌豆的葉柄是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳材料，在MS培養(yǎng)基中添加2，4－D（1mg／L）和BA（0.5mg／L），愈傷誘導(dǎo)率達(dá)100%，但愈傷組織在分化培養(yǎng)基中未能分化出芽；豌豆子葉節(jié)是芽分化的最佳材料，在分化培養(yǎng)基上可分化出叢生芽，不同激素條件下萌發(fā)率均達(dá)100%。在MS＋ZT（1mg／L）條件下，叢生芽最長(zhǎng)；而在MS＋BA（10mg／L）條件下，叢生芽最多。豌豆子葉節(jié)叢生芽在MS＋I(xiàn)BA （0.5mg／L）培養(yǎng)基上生根率最高，達(dá)40%以上，試管苗的移栽成活率為90%以上。

豌豆；組織培養(yǎng)；植株再生

豌豆是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，種子不僅可以糧用飼用［1］，而且豌豆嫩粒、嫰莢以及嫩苗等還可以作為蔬菜食用［2］。同時(shí)，由于豌豆根部共生有固氮根瘤菌，對(duì)于養(yǎng)地倒茬具有重要意義［3］。豌豆蛋白質(zhì)含量高［4］，富含膳食纖維、胡蘿卜素和微量元素等，具有較高的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值［5］。同時(shí)，豌豆還具有激活免疫系統(tǒng)及防治腫瘤等作用［6］。我國(guó)豌豆栽培歷史悠久，目前豌豆總產(chǎn)量居世界第2位［7］，但豌豆單產(chǎn)不高，經(jīng)濟(jì)效益較低，主要在云南、青海和甘肅等干旱、半干旱地區(qū)種植［8］，用于作物輪作倒茬，改良土壤［9－10］。隨著對(duì)豌豆制品的需求日益增長(zhǎng)［11］，有必要利用現(xiàn)代生物技術(shù)開(kāi)展豌豆的遺傳育種等研究工作，提高豌豆的品質(zhì)及其產(chǎn)量［12］。目前，關(guān)于豌豆組織培養(yǎng)以及遺傳轉(zhuǎn)化的研究較為滯后，因此，進(jìn)行糧用豌豆組織培養(yǎng)與植株再生技術(shù)試驗(yàn)，為其遺傳轉(zhuǎn)化及優(yōu)良品種快速繁殖奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

糧用豌豆由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 無(wú)菌苗獲得

挑選色澤鮮亮、粒大、飽滿(mǎn)、種皮無(wú)破損及無(wú)霉病斑的豌豆種子，先用自來(lái)水沖洗4～5次，在超凈臺(tái)上用75%的酒精浸泡1min，轉(zhuǎn)入0.1%HgCl2溶液中浸泡10min，無(wú)菌水漂洗4～5次，接種于MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)5～7d左右。

1.3 愈傷組織誘導(dǎo)

將一部分無(wú)菌苗保留葉柄部分，沿子葉縱向切開(kāi)，分別放入愈傷培養(yǎng)基［13］MS＋2，4－D（1mg／L）＋BA（0.5mg／L）、MS＋BA（1mg／L）、MS＋2，4－D （1mg／L）＋NAA（0.5mg／L）中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，統(tǒng)計(jì)出愈率并篩選出最佳的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基。

1.4 愈傷組織分化

將成功誘導(dǎo)出的愈傷組織放入附加不同激素濃度的BA和ZT培養(yǎng)基中，統(tǒng)計(jì)分化率、芽長(zhǎng)等指標(biāo)。

1.5 芽分化

將無(wú)菌苗的兩片子葉從子葉節(jié)處切開(kāi)，保留3～4mm下胚軸，切去已經(jīng)萌發(fā)的頂芽及側(cè)芽，分別放入芽分化培養(yǎng)基MS＋ZT（1mg／L）、MS＋BA （2mg／L）＋I(xiàn)BA（0.2mg／L）和MS＋BA（10mg／L）進(jìn)行叢生芽的誘導(dǎo)，統(tǒng)計(jì)分化率、芽長(zhǎng)等指標(biāo)。

1.6 根誘導(dǎo)

將叢生芽切下，分別放入生根培養(yǎng)基MS＋I(xiàn)BA （0.5～2mg／L）中進(jìn)行根的誘導(dǎo)，統(tǒng)計(jì)生根情況。

以上各項(xiàng)試驗(yàn)處理都為3次重復(fù)，培養(yǎng)基中附加3%蔗糖和0.7%瓊脂，pH 5.8，在室溫（25±1）℃，光照為40W日光燈每天光照14h培養(yǎng)，每10d觀(guān)察并記錄生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 豌豆葉柄愈傷組織的形成及芽分化

從表1看出，MS＋BA（0.5mg／L）＋2，4－D （1mg／L）和MS＋2，4－D（1mg／L）＋NAA （0.5mg／L）的培養(yǎng)條件下均可誘導(dǎo)出愈傷組織，且誘導(dǎo)率均較高，但形成愈傷組織的形態(tài)不一樣，前者愈傷組織呈淡黃色，質(zhì)地較緊實(shí)，是理想的愈傷組織材料。但附加不同激素濃度的BA，ZT各處理中均未分化出芽。上述結(jié)果與其他已報(bào)道的研究結(jié)果相似［14］。

2.2 豌豆子葉節(jié)的叢生芽萌發(fā)與生長(zhǎng)情況

從表2看出，直接把子葉節(jié)接種于各處理中，叢生芽產(chǎn)生率為100%，但平均芽長(zhǎng)、生長(zhǎng)情況呈一定差異。當(dāng)培養(yǎng)基中只加ZT（1mg／L）時(shí)，叢生芽通常為1～2個(gè)，多為2個(gè)，較粗，較長(zhǎng)，葉片呈張開(kāi)狀，說(shuō)明在此濃度下，有利于培養(yǎng)壯芽。當(dāng)培養(yǎng)基加有BA（2mg／L）和IBA（0.2mg／L）時(shí)，叢生芽通常為3～4個(gè)，多為4個(gè)，較細(xì)，較短，葉片呈閉合狀，說(shuō)明在此濃度下，有利于得到更多的叢生芽。當(dāng)培養(yǎng)基中只加有BA（10mg／L）時(shí)，由于激素濃度過(guò)高，雖然所得叢生芽數(shù)較多，但較細(xì)，較短，且顏色呈深綠色，無(wú)很強(qiáng)的生命力。因此，應(yīng)根據(jù)不同的需要選擇不同類(lèi)型的培養(yǎng)基。

表2 不同激素組合子葉節(jié)的叢生芽萌發(fā)及生長(zhǎng)情況Table 2 Germination and growth of buds clustered on pea cotyledon node treated with different hormone combination

2.3 叢生芽根的誘導(dǎo)

分化的叢生芽生長(zhǎng)到3～5cm時(shí)，分別接種于IBA（0.5～2mg／L）不同濃度的MS培養(yǎng)基中，10d左右在芽基部開(kāi)始膨大（圖示－1），15d左右可明顯觀(guān)察到在膨大的組織塊上有根出現(xiàn)，且逐漸伸長(zhǎng)，25d左右根的長(zhǎng)度達(dá)3cm以上（圖示－2）。從表3看出，根的誘導(dǎo)與IBA濃度有關(guān)，隨著IBA濃度的升高，根的誘導(dǎo)率反而下降，IBA為0.5mg／L時(shí)，誘導(dǎo)率可達(dá)43%。

圖示 豌豆子葉節(jié)叢生芽的生根誘導(dǎo)Fig. Rooting of adventitious buds on pea cotyledon node

表3 IBA對(duì)豌豆子葉節(jié)叢生芽根的誘導(dǎo)情況Table 3 Rooting of adventitious buds on pea cotyledon node treated with IBA

2.4 試管苗移栽

當(dāng)試管苗的主根伸長(zhǎng)約2cm，且長(zhǎng)出2～3條須根時(shí)，揭開(kāi)封口膜在室溫下煉苗7d后，將其根部的培養(yǎng)基用自來(lái)水沖洗干凈，移栽于營(yíng)養(yǎng)土中，澆足水分，保持濕度，成活率可達(dá)90%以上。

3 結(jié)論與討論

1）在組織培養(yǎng)中，選擇適合的外植體是組織培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵［15－16］。試驗(yàn)中，豌豆的葉柄是最佳形成愈傷組織的材料。但在隨后的誘導(dǎo)愈傷分化的試驗(yàn)中，附加不同激素濃度的BA，ZT處理中并未成功，從該愈傷組織中誘導(dǎo)芽有待進(jìn)一步研究。蘇承剛［2］等研究表明，食莢型豌豆的莖段誘導(dǎo)愈傷組織比率較高，但同樣也沒(méi)有誘導(dǎo)芽的產(chǎn)生。由此可見(jiàn)，豌豆葉柄愈傷組織難以誘導(dǎo)產(chǎn)生再生植株，不是遺傳轉(zhuǎn)化的理想材料。

2）將豌豆的子葉節(jié)接種于附加激素BA、ZT和IBA不同組合的分化培養(yǎng)基中，3d左右直接從節(jié)上萌發(fā)出多個(gè)腋芽，萌發(fā)率達(dá)100%，腋芽的形態(tài)與其附加的激素種類(lèi)及濃度有關(guān)，若濃度太高，不但不會(huì)促進(jìn)叢生芽的生長(zhǎng)，反而抑制其進(jìn)一步分化，因此，應(yīng)掌握好濃度的選擇。叢生芽在MS＋I(xiàn)BA （0.5mg／L）培養(yǎng)基上，生根率超過(guò)40%，試管苗的移栽成活率為90%以上。

3）目前已經(jīng)獲得的轉(zhuǎn)基因植物中，80%以上都是通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得［17］。而農(nóng)桿菌侵染的組織細(xì)胞往往通過(guò)組織培養(yǎng)的方式獲得再生植株，如煙草葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法［18］。在大豆的組織培養(yǎng)中，雖然初生葉，幼胚軸等各種外植體都有成功報(bào)道，但子葉節(jié)仍然是用于遺傳轉(zhuǎn)化的主要材料［19－21］。因此，通過(guò)農(nóng)桿菌侵染豌豆子葉節(jié)，而后進(jìn)行組織培養(yǎng)，還是較為理想的豌豆遺傳轉(zhuǎn)化方法。

［1］周俊玲，張蕙杰.世界豌豆生產(chǎn)及貿(mào)易形勢(shì)分析［J］.世界農(nóng)業(yè)，2015（9）：131－135.

［2］蘇承剛，吳學(xué)科，鄭占偉，等.食莢型豌豆組織培養(yǎng)和植株再生研究［J］.西北師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，32（4）：30－32.

［3］楊曉明，任瑞玉.國(guó)內(nèi)外豌豆生產(chǎn)和育種研究進(jìn)展［J］.甘肅農(nóng)業(yè)科技，2005（8）：3－5.

［4］單 宏.鹽法提取豌豆分離蛋白凝膠特性及影響因素［J］.食品科學(xué)，2015，36（5）：72－76.

［5］Sandberg A S.Bioavailability of minerals in legumes ［J］.British Journal of Nutrition，2002，88（S3）：281－285.

［6］梁晗妮，唐傳核.豌豆蛋白質(zhì)的功能特性研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2012，28（12）：1639－1644.

［7］宗緒曉，關(guān)建平，王海飛，等.世界栽培豌豆資源群體結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性研究［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43 （2）：240－251.

［8］王 劍，肖 貴.豌豆品種（系）比較試驗(yàn)研究［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2015（6）：99－100.

［9］周艷琳，曾小波，田夢(mèng)洋，等.豌豆根瘤菌透性酶基因突變體的構(gòu)建及其功能研究［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54（18）：4613－4616.

［10］Mcallister L J，Tseng H J，Ogunniyi A D，et al.Molecular analysis of the pea permease complex of Streptococcus pneumoniae［J］.Molecular Microbiology，2004，53（3）：889－901.

［11］張 春，童雅晴，張少斌.低溫脅迫對(duì)豌豆肌動(dòng)蛋白異型體PEAcII基因表達(dá)的影響［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（8）：26－29.

［12］Zhang S B，Cheng F S，Wang C，et al.Cloning and tissue－specific expression of predicted pisum sativum actin isoform PEAc14－1［J］.Biochemical Genetics，2013，51（9－10）：1－6.

［13］王江波，賈敬芬.發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化海邊香豌豆及轉(zhuǎn)化體的體細(xì)胞胚胎發(fā)生［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2002，8（2）：190－194.

［14］白守信，梁紅衛(wèi).豌豆組織培養(yǎng)中的器官發(fā)生及影響分化頻率的幾個(gè)因素［J］.西北植物研究，1983，3（1）：49－55.

［15］Murashige T，Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures ［J］.Physiol Plant，1962，15（5）：473－497.

［16］馬曉紅，姚陸銘，武天龍.大豆整個(gè)子葉節(jié)外植體系的建立及與子葉節(jié)、胚尖再生體系的比較［J］.大豆科學(xué)，2008，27（3）：373－378.

［17］王關(guān)林，方宏筠.物基因工程原理與技術(shù)［M］.北京：科學(xué)出版社，1998：361.

［18］張 寧，王 蒂.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草高效遺傳轉(zhuǎn)化體系研究［J］.甘肅農(nóng)業(yè)科技，2004（9）：11－13.

［19］袁 鷹，劉德璞，鄭培和，等.大豆組織培養(yǎng)再生植株研究［J］.大豆科學(xué)，2001，20（1）：9－13.

［20］劉海坤，衛(wèi)志明.利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化大豆成熟種子胚尖獲得轉(zhuǎn)基因植株［J］.植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，2004，30（6）：631－636.

［21］李文霞，寧海龍，李文濱.大豆遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，12（31）：67－71.

（責(zé)任編輯：聶克艷）

Condition optimization on Tissue Culture and Plant Regeneration of Pea

LIU Hui1，ZHAO Yishi2，WU Chen2，ZHANG Shaobin2＊

（1.College of Land and Environment，Shenyang Agricultural University，Shenyang，Liaoning110866；2.Biological Science and Technology College，Shenyang Agricultural University，Shenyang，Liaoning 110866，China）

In order to provide references for pea genetic transformation and the rapid propagation of fine varieties，the experiment of tissue culture and plant regeneration of pea was carried out.Results：Pea petiole is the ideal inducing material for callus，2，4－D（1mg／L）and BA（0.5mg／L）were added into MS medium，and the callus induction rate reached 100%，but there were no buds on differentiation medium.Pea cotyledon was the best differentiation material，the germination rate of the cluster buds was up to 100%using different hormones.Under the condition of MS medium with ZT（1mg／L），the cluster buds were the longest，while the number of buds was the most on the MS medium with BA（1mg／L）.The rooting rate of cluster buds was the highest on the MS medium with IBA（0.5mg／L），which could reach more than 40%.The surviving ratio of transplanted plants could exceed 90%.

pea；tissue culture；plant regeneration

S529

A

1001－3601（2016）07－0284－0006－03

2015－11－02；2016－07－01修回

遼寧省自然科學(xué)基金“肌動(dòng)蛋白異型體PEAC3在干旱脅迫中的作用及其響應(yīng)機(jī)制”（2013020072）

劉 慧（1973－），女，實(shí)驗(yàn)師，從事植物資源與環(huán)境研究。E－mail：187021941＠qq.com

＊通訊作者：張少斌（1973－），男，副教授，博士，從事植物細(xì)胞骨架研究。E－mail：zsb010024＠163.com