不同培養條件對綿羊卵母細胞體外成熟和凋亡的影響

陳魯杰，梁浩勤，賴露菊，趙宏偉，魏鎖成（西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730030）

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不同培養條件對綿羊卵母細胞體外成熟和凋亡的影響

陳魯杰，梁浩勤，賴露菊，趙宏偉，魏鎖成*
（西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730030）

摘要：目的，探討不同溫度和不同培養時間對綿羊卵母細胞體外培養，成熟和凋亡的影響，選擇合適的溫度和培養時間為綿羊卵母細胞進行體外成熟提供技術支持。方法：在綿羊死亡30 min之內取出卵巢4～6 h帶回實驗室，切割法收集卵母細胞。在5%CO2、飽和濕度等條件相同情況下，分別在36.0℃、37.0℃、37.5℃、38.0℃、38.5℃、39℃下培養24～26 h。實驗中獲得的結果數據，采用t檢驗方法進行差異顯著性分析。結果：26 h的成熟率高于其他4個時間的成熟率，在培養22 h到26 h過程中，隨著培養時間的增加，卵母細胞的成熟率呈增高。但是在26 h過后，隨著培養時間增加，卵母細胞的成熟率呈遞減趨勢，至30 h卵母細胞的成熟率明顯低于22 h的成熟率。38.5℃時卵母細胞的成熟率最高，36℃是卵母細胞的凋亡率最高。卵母細胞成熟率的整體趨勢是隨著溫度的上升呈正相關。

關鍵詞：卵母細胞；成熟率；凋亡率；卵巢；體外培養

項目來源：西北民族大學研究生科研創新項目（編號：YCX14168）。

隨著胚胎工程技術的發展，對胚胎的需求量越來越大，如體外受精、轉基因、核移植、外源基因的倒入等均需要卵母細胞，而卵母細胞的成熟發育與胚胎有著緊密的聯系，卵母細胞的體外成熟技術日益受到重視［1］。Pincus等（1935）首先提出了卵母細胞的體外成熟（IVM），Edwards（1965）對動物的細胞進行了體外成熟研究。我國于1985年后20世紀80年代末期才開始研究家畜卵母細胞體外成熟培養技術。

21世紀，對卵母細胞的體外成熟技術提出了更高要求，因為如果體外成熟技術不過關，體外成熟卵母細胞質量有問題，對以后哺乳動物體外受精、轉基因、核移植、外源基因的導入等會造成極大的影響。所以卵母細胞體外成熟培養體系的完善成了生物學家們最重視的科學技術。對綿羊卵母細胞體外成熟培養技術研究較晚也比較遲緩，導致培養技術缺乏。因此，開發和研究綿羊的卵巢卵母細胞體外成熟培養技術，建立和完善一套完全在體外環境下快速生產和保存大量品質優良、價格低廉的卵母細胞的技術勢在必行。卵母細胞體外成熟培養受很多因素的影響，如：培養的時間、溫度、CO2濃度、濕度、培養基成分（如激素、生長因子等）、動物的年齡、卵巢采集的季節等。關于這些因素對卵母細胞的體外成熟的作用效果的研究不多見，雖然文獻記載單一因素的報道，但是多因素綜合作用的研究鮮見。

自從1878年德國科學家Scherk對家兔和豚鼠進行了體外受精的嘗試以來，許多的科學家對此進行了研究［1］。過去若干年里，人們為探索早期胚胎最佳的體外培養系統做了大量工作［2］。現在已應用卵母細胞體外成熟（in vitromaturation，IVM）和體外受精技術體外生產胚胎［3］。經過研究者不斷地努力已被世界各國實驗室所采用，并且已在世界上進行了商業性應用（1987年在愛爾蘭建立的商業性卵子公司集團Ovamass Ltd.，主要生產肉牛、羊胚胎），產生了重大的經濟效益［4，5］。目前，體外受精的各個步驟：卵母細胞的體外成熟、精子的體外獲能、卵母細胞的體外受精、受精卵的體外發育以及配子和胚胎的冷凍保存等，都可在體外進行［6］。哺乳動物早期胚胎體外培養效果已經可以為胚胎生產產業化服務，但是最適合卵母細胞體外生長發育的條件還沒有完全確定［7，8］。蘭州大尾羊是蘭州地區的特有羊品種，然而，蘭州大尾羊的數量目前只有3 000～4 000只，屬瀕危品種，被列入中國畜禽遺傳資源目錄和國家級畜禽種質資源保存目錄。因此其數量遠遠不能滿足市場需求，養殖技術較落后，沒有形成規模，也還不是畜牧業養殖的支柱畜種，對當地農民致富也沒有明顯的帶動作有，急需要改良，對其擴繁和保護已刻不容緩。通過超數排卵技術和胚胎移植技術的推廣應用，可以提高繁殖能力和生產性能，提升產羔率，達到年產2胎，增加存欄量和出欄數，力爭數量在5年內翻一番，加快生長發育，增加產毛量，毛皮質量明顯提高，具有廣闊的市場前景和顯著地經濟效益［9］。

卵母細胞的體外培養是胚胎移植技術的關鍵步驟。但是，蘭州大尾羊卵母細胞體外保存的合適溫度還不清楚，培養的合適溫度還沒確定等一系列問題，對胚胎移植技術有一定影響。本研究就是為了解決此類問題。對蘭州大尾羊卵母細胞的體外培養進行進一步研究，為蘭州大尾羊胚胎移植技術中的卵母細胞體外培養提供理論基礎。

1　不同溫度對綿羊卵母細胞體外成熟的作用

1.1材料

1.1.1實驗材料2～3歲成年綿羊卵巢，采自蘭州市小西湖馬忠華定點屠宰場。

1.1.2實驗試劑與藥品NaCl，KCl，CaCl·2H2O，KH2PO4，MgCl2·2H2O，Na2HPO4·12H2O，NaHCO3，丙酮酸鈉，葡萄糖，青霉素，鏈霉素，M199，LH（促黃體素，規格：4μg×10支），FSH（促卵泡素，規格：100單位×10支），E2（雌二醇，規格：4 mg×10支）三種激素均為寧波市三生藥業有限公司產品，發情羊血清。

1.1.3主要儀器設備體視顯微鏡（LEICA DMIL產自北京悅昌行科技有限公司）；倒置顯微鏡（LEICA S8APO產自北京悅昌行科技有限公司）；超凈工作臺（產自蘇州智凈凈化設備有限公司）；CO2培養箱（STIK，型號IL- 161CT產自施都凱儀器設備（上海）有限公司）；電子天天平（FA2004N產自上海精密科學儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備限公司）；高壓滅菌鍋（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；一次性培養皿（35 mm×10 mm）；吸胚針；注射器及手術刀等。

1.1.4培養液的配制雙抗（P/S）制備：青霉素160萬單位，加上80 ml的超純水，變成青霉素2萬單位/ml；鏈霉素100萬單位，加上50 ml的超純水，變成鏈霉素2萬單位/ml；青霉素和鏈霉素各取50 ml，再用超純水稀釋100倍，使得培養基中每毫升青霉素鏈霉素100個單位。

PBS液：NaCl 800 mg/100 ml，KCl 20 mg/100ml，CaCl2取13 mg/100ml，MgCl2取10 mg/100 ml，磷酸氫二鈉289.8 mg/ml，丙酮酸鈉3.6 mg/100 ml，C6H1206取5.56 mmol/L，定容至100 ml的超純水中，用一次性過濾器過濾除菌后，放置4℃冰箱內保存，以待備用。

M199基礎液：M199 0.22 g，NaHCO30.95 g，三蒸水定容100 ml。用0.4 μm的過濾器過濾除菌，4℃保存。

洗卵液（撿卵液）：M199基礎液99 ml，丙酮酸鈉0.22 μg/ml，1%雙抗。用0.4 μm的過濾器過濾除菌，4℃保存。

發情羊血清（ESS）的制備：從甘肅省臨夏市和政縣泰祥三谷產業園采回發情羊血清，血樣必須在于4℃冰箱內放置1～2h后，再用離心機用2 500 r/min的轉速離心20 min，取其中的血清。將分離好的血清在56℃條件下，滅活30 min，最后進行過濾分裝。

成熟液：M199基礎液8 ml，LH（促黃體素）50 μg，FSH（促卵泡素）5 μg，E2（雌二醇）10（取1 ml用三蒸水稀釋20倍，取1 ml），發情羊血清1 ml，雙抗0.1 ml。用0.4 μm的過濾器過濾除菌，4℃保存。

1.2方法

1.2.1綿羊卵巢的采集在綿羊宰殺30 min之內取出卵巢，放入事先準備好的裝有35～37℃的含有0.9%的青、鏈霉素的生理鹽水的保溫瓶中，4～6 h內帶回實驗室進行實驗。卵巢置于含青、鏈霉素的35～37℃生理鹽水的培養皿中，用滅菌的37℃的生理鹽水沖洗卵巢2～3遍，剔除卵巢表面及周圍的脂肪、結締組織和系膜。一只手持鑷子固定卵巢，另一手拿眼科剪將卵巢表面的卵泡剪破，使卵泡液流出。較小的卵泡則將其所在卵巢表面剪碎，但不完全剪碎卵巢，盡可能地減少組織塊。最后再用PBS液沖洗剪碎的卵巢表面，使附著在上面的卵母細胞流入PBS液中。然后靜置1～2 min后在體視顯微鏡下用吸胚針進行撿卵。

1.2.2卵母細胞的收集卵巢經過處理后用切割法收集卵母細胞。在倒置顯微鏡下用吸胚針挑出卵丘細胞層完整、包裹致密，卵母細胞胞質顏色均勻的卵丘——卵母細胞復合體（cumulus- oocyte- complexes，COCs）用于體外成熟培養。COCs在洗卵液中清洗3～4遍。最后，從洗卵液中把COCs移至預平衡2～4h的微滴中培養。

1.2.3卵母細胞的分級標準將不同采集方法收集到的卵泡液置于體視顯微鏡下進行觀察，收集卵母細胞，并對收集到的卵母細胞進行分級評價。根據包被卵母細胞的卵丘細胞完整性、卵丘細胞層數以及卵母細胞的胞質均勻性將卵母細胞分為4級：A級，卵丘細胞三層以上，胞質均勻；B級，1～2層卵丘細胞，胞質均勻；C級，裸卵或卵丘細胞不完整；D級是死亡退化的卵母細胞。A/B級卵母細胞為可用的卵母細胞。

1.2.4綿羊卵母細胞體外成熟培養本實驗采用微滴培養方法：取一35 mm培養皿，先在培養皿中用成熟培養液做成80 μl的微滴，每個培養皿均勻分布4～5滴；然后加入1 ml滅菌石蠟油均勻覆蓋住微滴，在培養箱中平衡2h以上。COCs洗凈后穿破石蠟油放入微滴中，每微滴培養卵母細胞15～30枚左右，數量過多或過少均會影響卵母細胞的體外成熟。

在38.5℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養。培養一定時間后，用透明質酸將COCs經移液槍反復吹打分離卵母細胞及卵丘細胞，并用PBS清洗2～3遍收集卵母細胞，看第一極體排出的情況。卵母細胞成熟的一個重要指標就是卵丘細胞的擴散，將卵母細胞成熟后的卵丘細胞擴散程度分為4級（圖1）。

圖1　電鏡下的卵母細胞a：1級；b：2級；c：3級（10×10）.

1.2.5實驗設計實驗一為在5%CO2濃度與飽和濕度等條件相同情況下，分別在36.0℃、37.0℃、37.5℃、38.0℃、38.5℃、39℃下培養24～26 h。

實驗二是在5%CO2濃度與培養溫度（38.5℃）相同條件下，培養22 h、24 h、26 h、28 h和30 h。

最后放在透明質酸酶中反復吹打去除顆粒細胞，并用PBS液清洗2～3遍收集卵母細胞，統計第一極體的排出情況。

1.2.6成熟卵母細胞的判定卵細胞的成熟包括核成熟和胞漿成熟。第一極體的排出是卵母細胞體外培養成熟的標志，也是細胞核成熟的標志，胞質成熟的是以卵丘細胞擴散為標志。

細胞核成熟的判定方法：卵母細胞成熟培養20～24 h后，挑選卵丘層擴散良好的COCs，放在含有0.3% BSA（Sigma）的HEPES- TALP液中，旋渦振蕩5 min，徹底去除卵丘細胞，在體視鏡下觀察第一極體排出情況。取部分卵放到四角滴有石蠟油：凡士林（1∶9）的載玻片上，加蓋玻片，在顯微鏡下邊觀察邊逐漸輕輕向下壓，直到卵胞質充滿卵腔為止。放入無水乙醇：冰乙酸（3∶1）固定液中固定24 h以上，再用1%的醋酸地衣紅（45%醋酸配制）染色1～2 min，倒置顯微鏡下觀察卵母細胞核形態。

圖2　成熟前后不同時期的綿羊卵母細胞A.綿羊未成熟卵母細胞（×100），周圍有3～4層顆粒細胞包裹，同時有一薄層完整的透明帶形成；B.綿羊成熟卵母細胞（×100），完成第二次減數分裂，顆粒細胞層明顯膨大，以卵母細胞為中心呈放射狀向四周擴散；C.排出第一極體的綿羊卵母細胞（×200），透明帶明顯增厚，細胞核被擠到一邊，第一極體排出。

1.2.7結果統計實驗中獲得的結果數據，采用t檢驗方法進行差異顯著性分析。

1.3實驗結果

表1　培養條件綿羊卵母細胞體外成熟的影響

卵母細胞培養不同時間后的成熟率見表1和圖2。26 h的成熟率高于其他4個時間的成熟率，在培養22 h 到26 h過程中，隨著培養時間的增加，卵母細胞的成熟率呈增高。但是在26 h過后，隨著培養時間增加，卵母細胞的成熟率呈遞減趨勢，至30 h卵母細胞的成熟率明顯低于22 h的成熟率。

圖3　培養溫度與卵母細胞成熟率和凋亡率

根據表1和圖2均顯示培養溫度越高，細胞成熟率越高。經過許多研究證明，產生這種情況的原因主要是由于細胞內活性物質的活性決定的。在動物正常的生理溫度范圍內，卵母細胞的代謝強度與溫度成正比，溫度升高，酶、激素等活性物質的活性也隨之升高，細胞代謝也增強，成熟率就會升高。但是溫度過高或過低均會影響卵母細胞的生長和成熟。當溫度過高到達一定限度時會導致酶、激素等的失活，同時會破壞細胞膜的結構，導致滲透性改變，甚至引起細胞死亡［10］。當溫度略低于正常溫度時，對卵母細胞沒有重大影響，但是會引起細胞內活性物質的活性降低，細胞代謝減弱，導致卵母細胞的生長發育受到抑制，所以產生了36～37.5℃的成熟率較低的情況。實驗結果顯示綿羊在39.0℃時成熟率最高，可能是細胞內的各種酶和激素等物質的活性最強，細胞代謝旺盛，所以成熟率最高。經過查證大量資料顯示在培養溫度高于綿羊正常體溫時，由于破壞了細胞結構，細胞成熟率會降低。所以反證本實驗培養溫度越高，細胞成熟率越高；39.0℃在綿羊正常體溫范圍（38.3～39.9℃）內成熟率最高，符合以前的研究成果。

適宜的培養溫度是哺乳動物卵母細胞體外成熟培養成功的一項重要因素，然而不同的哺乳動物卵母細胞培養的最適溫度也不相同。經Lenz（1983）研究顯示牛卵母細胞對溫度的敏感性很強，Wang通過組合實驗證明在38～39℃是牛的卵母細胞體外成熟的最適溫度。Eng（1986）指出豬的卵母細胞在39℃下體外培養成熟率比在37℃下高。戴榮亮等人也證實了體外培養溫度在山羊正常體溫（38.5～39.7℃）范圍內變動，對卵母細胞成熟率無顯著影響［11］。本實驗證實，只要在綿羊正常體溫范圍（38.3～39.9℃）內變動，則對成熟率無顯著影響，符合以前的研究成果。雖然在實際生產活動中的培養環境遠遠不如實驗室嚴密和完備，但是只要控制在綿羊的正常生理溫度范圍內，卵母細胞的成熟率是可以保證。

2　討論

2.1不同溫度對綿羊卵母細胞的體外成熟影響

適宜的培養溫度是成功進行卵母細胞體外成熟培養的重要因素，然而不同的哺乳動物卵母細胞培養的最適溫度也不相同。在這項研究中，卵母細胞的成熟率，隨著培養溫度從36.0℃升至38.5℃，逐漸增加。最大的成熟率和最小細胞凋亡率在38.5℃時出現。許多研究證明，產生這種情況的原因主要是由于細胞內活性物質的活性決定的。在動物正常的生理溫度范圍內，卵母細胞的代謝強度與溫度成正比，溫度升高，酶、激素等活性物質的活性也隨之升高，細胞代謝也增強，成熟率就會升高。但是溫度過高或過低均會影響卵母細胞的生長和成熟。當溫度過高到達一定限度時會導致酶、激素等的失活，同時會破壞細胞膜的結構，導致滲透性改變，甚至引起細胞死亡［10］。有實驗結果顯示綿羊在39.0℃時成熟率最高。戴榮亮等證實生理體溫（38.5～39.7℃）范圍內變動對山羊卵母細胞體外成熟率無顯著影響［12］。綿羊母細胞體外成熟率在正常體溫范圍（38.3～39.9℃）也無明顯差異［10］。Eng等研究發現，39℃時豬卵母細胞的成熟率為71.0%，37℃時為35%。劉靈39℃時培養山羊卵母細胞，獲得79.4%的成熟率。張涌等在38.5℃的條件下培養山羊卵母細胞，成熟率為68.4%［12］。

2.2培養時間對卵母細胞體外成熟培養的影響

徐燕霞等（2014）報道培養20 h的卵母細胞的成熟率為57.8%，培養22 h的成熟率為63.6%，培養24 h 為64.4%，培養26h為72.5%，培養20 h和22 h的成熟率差異顯著；培養20 h和24 h、26 h的成熟率差異極顯著；培養22 h和24 h成熟率差異不顯著；培養24 h和26 h差異極顯著。隨著培養時間的延長，卵母細胞的成熟率在提高，但是時間太長，卵母細胞就會老化，不利于卵母細胞的體外受精。王超（2007）和楊志杰等（2008）的研究結果顯示培養24 h、26 h的卵母細胞成熟率顯著高于18 h和20 h的。呂麗華等（2009）研究了山羊培養24 h、27 h、30 h后卵母細胞的成熟率，結果顯示培養27 h卵母細胞成熟率顯著高于其他2組。不同物種卵母細胞成熟時間不同，牛卵母細胞需要24 h就成熟，但是豬卵母細胞的成熟需要培養42～48 h。卵母細胞體外培養時間對卵母細胞的成熟及其之后的體外受精和早期胚胎的發育非常重要，卵母細胞培養時間太短不易成熟，但是時間太長容易造成卵母細胞透明帶硬化，從而不適合受精。因此卵母細胞的成熟培養時間對卵母細胞的成熟和體外受精非常重要，具有深遠的意義。本試驗結果說明，綿羊的卵母細胞培養22～24 h成熟率高且利于體外受精。

3　結論

試驗結果表明，用切卵法收集卵母細胞之后，在5%CO2，培養26 h，飽和濕度的條件下培養溫度38.5℃時綿羊卵母細胞的成熟率最高、凋亡率最低。在5% CO2，培養溫度38.5℃，飽和濕度的條件下培養26 h時綿羊卵母細胞的成熟率是37.3%最高，凋亡率是25.4%最低。

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（編輯：高真貞）

中圖分類號：S814.4

文獻標識碼：B

文章編號：1006- 799X（2016）05- 0076- 05

作者簡介：陳魯杰（1986-），男，河南商水人，在讀碩士研究生，主要從事動物醫學生殖技術研究。

通訊作者：魏鎖成（1962-），男，甘肅甘谷人，教授，主要從事動物生殖生物技術的教學和科研工作。