蘭州黑白花奶牛腎組織細胞系的建立

令世鑫，徐水林，馬　偉，馬桂蘭，馬　花，王家敏，馬忠仁，喬自林*（.西北民族大學甘肅省動物細胞工程技術研究中心，甘肅蘭州730030；.蘭州百靈生物技術有限公司，甘肅蘭州730030）

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蘭州黑白花奶牛腎組織細胞系的建立

令世鑫1，徐水林2，馬偉1，馬桂蘭2，馬花1，王家敏1，馬忠仁1，喬自林1*
（1.西北民族大學甘肅省動物細胞工程技術研究中心，甘肅蘭州730030；
2.蘭州百靈生物技術有限公司，甘肅蘭州730030）

摘要：目的：通過體細胞分離培養和保存，在細胞水平上保存蘭州黑白花奶牛的種質資源。方法：采用胰蛋白酶熱消化分離培養蘭州黑白花奶牛的腎組織細胞，傳代擴大培養后液氮保存，對保存的細胞進行了復蘇活力、形態、生長特性、微生物和內外源病毒因子檢查。結果：保存的蘭州黑白花奶牛腎細胞復蘇活力達94%，生長良好，形態以梭形和上皮形為主，生長曲線呈近“S”型，最大增殖濃度3.89×105/ml，倍增時間為27.15 h，無菌、支原體和內外源病毒因子檢查為陰性。結論：成功建立了蘭州黑白花奶牛腎組織細胞系，使種質資源在細胞水平上得以長期保存。

關鍵詞：蘭州黑白花奶牛；腎細胞；種質資源

蘭州黑白花奶牛是經過四十多年的雜交選育培育出的一種適應于西北地區環境條件的乳用牛品種，是甘肅省地方牛品種荷斯坦奶牛——甘肅類群的重要組成部分，現為以蘭州市花莊奶牛繁殖場為核心的擴繁群以及蘭州市城鄉結合部的散養分布特征［1，2］。蘭州黑白花奶牛育成以后研究主要集中于飼養管理、生產狀況和疾病防治等方面，對于種質資源的保存主要是建立純種群和擴繁群方式，僅通過品種選育實施原位保存方式。在實施國家自然科技資源共享平臺項目《畜禽種質資源收集、整理與保存》以來，先后有幾百個品種的家養和野生畜禽的種質資源在細胞或基因水平上得到了長期保存。蘭州黑白花奶牛是經長期人工培育形成的甘肅地方品種，在體貌特征、生產性能和適應性等方面已形成了品種特征，其種質資源應有多方面的保護措施，為此開展體細胞系的建立和保存工作。

1　材料與方法

1.1材料

蘭州黑白花奶牛腎組織采自蘭州花莊奶牛繁殖場

出生的新生小牛公母各兩頭。DMEM（Gibco）、0.2%胰蛋白酶（蘭州百靈生物）、胎牛血清（蘭州民海生物，添加比例為10%）、DMSO（ThermoFisher）、無菌和支原體檢查培養基（北京三藥）、Hoechst33258（Sigma）、病毒熒光抗體結合物（VMRD）、病毒檢查傳代細胞（本室保存）、雞和豚鼠紅細胞等。主要儀器設備有CO2培養箱（Thermo，3111型）、倒置相差顯微鏡（Olympus，CK40- 32PH型）、熒光倒置相差顯微鏡（Olympus，IX71型）、液氮罐（樂山東亞）等。

1.2方法

1.2.1組織采集新生小牛剛采集完血液后快速剝去牛皮，從腹部中間縱向切開，將腹腔部分內臟移出使一側腎臟完全暴露，連包裹的脂肪一起用手摘下，必要時借助器械剪斷血管或輸尿管，在陰涼處放置10～20 min，使表層脂肪稍微凝固裝入自封袋并標記性別，放入裝有凍袋的泡沫箱中6 h內帶到實驗室分離培養細胞。

1.2.2分離細胞和原代培養按文獻方法采用胰蛋白酶熱消化法分離培養細胞［3］。

1.2.3傳代培養和細胞凍存顯微鏡下原代培養的細胞形成較致密的細胞層時用胰蛋白酶消化按1∶2比例傳代培養，此后按1∶3比例傳代。第三次傳代時擴大培養數量，在對數生長期末期消化后按2.0×106/ml左右密度在液氮中凍存，凍存保護液為10%DMSO+20%胎牛血清+70%DMEM。每個個體的腎細胞凍存30支，每支裝量1 ml。

1.2.4細胞鑒定按文獻方法檢定凍存細胞的活力、形態、生長特征、無菌和支原體以及致細胞病變、血細胞吸附和特異性病毒外源因子［4］。

2　結果

2.1原代培養和傳代培養

蘭州黑白花奶牛腎組織消化培養的原代細胞分離接種培養48 h可見有細胞貼壁分裂生長，多為梭形和扁平樣上皮形細胞簇，換液后細胞生長變快，96 h時大部分視野長成致密單層，以長梭形細胞為主，細胞長勢旺盛，致密的細胞層呈流水樣走勢。原代細胞以1∶2比例傳代培養時48 h成很致密單層細胞，此后1∶3比例傳代也在48 h成致密單層，如圖1。

圖1　蘭州黑白花奶牛腎細胞形態圖（a.原代培養第2天；b.原代培養第96 h；c.第一代48 h；d.復蘇后48 h）

2.2細胞凍存

對傳代培養第三代的腎細胞在液氮中凍存，四個個體的細胞凍存時的平均密度為2.12×106/ml，平均活力為96.2%。2.3細胞鑒定

2.3.1復蘇活力平均復蘇活力為94%，比凍存前有所下降。

2.3.2細胞形態復蘇后培養48 h時在培養瓶90%以上生長面長滿細胞，形態以梭形和扁平上皮形為主，梭形細胞邊緣清晰，上皮形細胞邊緣模糊成片生長。

2.3.3生長特征蘭州黑白花奶牛腎細胞生長曲線呈“S”型，如圖2，平均最大增值濃度為3.89×105/ml，倍增時間為27.15 h。

圖2　蘭州黑白花奶牛腎細胞生長曲線圖

2.3.4無菌檢查細胞培養48 h的培養基接種到硫乙醇酸鹽（37℃）、酪胨瓊脂培養基（37℃）和葡萄糖蛋白胨培養基（25℃）中培養7 d均沒有菌生長。2.3.5支原體檢查細胞培養48 h的培養液接種到支原體液體基和固體培養基上均未檢出支原體生長；細胞凍融處理的上清液接種Vero細胞上熒光染色后，只觀察到細胞核有藍色熒光，其它部位沒有熒光，如圖3。

圖3　蘭州黑白花奶牛腎細胞支原體檢查結果圖（a.陽性對照；b.陰性對照；c.樣品）

2.3.6內、外源病毒因子檢查細胞培養直接觀察和血吸附試驗細胞形態正常，無血細胞吸附現象；凍融后的上清液接種Vero和MRC- 5細胞培養觀察和血凝試驗的兩種細胞均形態正常，血凝試驗為陰性；細胞凍融后的上清液接種牛腎原代細胞用熒光抗體結合物檢查牛腹瀉病毒（BVDV）和呼腸孤病毒（REO），染色后未呈現特異性熒光，表明細胞沒有內外源病毒污染，如圖4。

圖4　蘭州黑白花奶牛腎細胞免疫熒光法檢查病毒結果圖

3　結論

畜禽種質資源是以物種為單元的遺傳多樣性資源，是關系到畜牧業可持續發展和生物多樣性以及人類社會可持續發展的重要物質基礎，也是生態系統的有機組成。動物的體細胞包含物種的全部遺傳信息，構建畜禽種質資源細胞庫，可實現對種質資源的永久保存［5］。蘭州黑白花奶牛是甘肅省優良地方品種，用胰蛋白酶熱消化新生小牛腎組織分離培養保存的細胞生長良好，沒有內外源微生物污染，使這一重要物種的種質資源在細胞水平上得以保存，也為相關遺傳學研究提供理想的生物材料。

參考文獻：

［1］趙國琳.甘肅省地方畜禽品種資源［M］.蘭州：甘肅科學技術出版社，2013.

［2］孫連科.蘭州黑白花奶牛泌乳規律及其分布［J］.甘肅畜牧獸醫，1988，（06）：7.

［3］喬自林，令世鑫，馮若飛，等.灘羊腎和耳緣組織細胞的分離培養與鑒定［J］.畜牧與獸醫，2012，44（11）：64-66.

［4］魏園園，馬忠仁，王家敏，等.PK15細胞的生物學特性和質量評價研究［J］.黑龍江農業科學，2015，（5）：61-65.

［5］中國科學院生物多樣性委員會.生物多樣性（譯）［M］.北京：中國科學技術出版社，1990.

（編輯：高真貞）

中圖分類號：S826.89

文獻標識碼：B

文章編號：1006- 799X（2016）05- 0068- 02

基金項目：蘭州市科技計劃項目（2006- 2- 59）

作者簡介：令世鑫（1966-），男，甘肅通渭人，工程師，主要從事家養動物種質資源保護利用工作。

通訊作者：喬自林（1976-），男，甘肅永靖人，高級實驗師，主要從事動物細胞培養技術工作。