康復新液對2，4-二硝基氯苯聯合醋酸誘導大鼠潰瘍性結腸炎的影響

王朋川，何　苗，張漢超，李貴軻，4，李　輝，張成桂*

（1.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南大理　671000；2.藥用特種昆蟲開發國家地方聯合工程研究中心，云南大理　671000；3.大理大學藥學與化學學院，云南大理　671000；4.四川好醫生藥業集團，成都　610000）

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康復新液對2，4-二硝基氯苯聯合醋酸誘導大鼠潰瘍性結腸炎的影響

王朋川1，2，3，何苗1，2，張漢超1，2，3，李貴軻1，2，4，李輝1，2，3，張成桂1，2*

（1.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南大理671000；2.藥用特種昆蟲開發國家地方聯合工程研究中心，云南大理671000；3.大理大學藥學與化學學院，云南大理671000；4.四川好醫生藥業集團，成都610000）

［摘要］目的：探討中藥康復新液經灌腸給藥對2，4-二硝基氯苯聯合醋酸誘導大鼠結腸炎的治療作用。方法：采用灌腸給藥方式對潰瘍性結腸炎（UC）模型大鼠進行治療，通過測定大鼠DAI指數、臟器指數，檢測血清IL-4、IL-10的表達水平，觀察結腸黏膜損傷程度及病理改變來評價康復新液對大鼠UC的影響。結果：陽性藥美沙拉嗪及治療藥物康復新液均能改善UC大鼠結腸組織的病變程度，修復腸道受損黏膜，病理組織學評分明顯下降并具有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05），提示灌腸有明顯的治療效果；康復新液高、中、低劑量組均能不同程度的降低DAI評分、結腸指數，緩解黏膜水腫，提高IL-4（P＜0.01）、IL-10（P＜0.01）的表達水平。從黏膜損傷及病理組織學評分可見康復新液組促進潰瘍面愈合的效果更優。結論：康復新液對DNCB聯合醋酸誘導的UC大鼠有治療作用，可有效促進UC大鼠結腸潰瘍的愈合，能有效的減輕UC大鼠的腹瀉癥狀（DAI評分降低）。

［關鍵詞］康復新液；美沙拉嗪；灌腸；潰瘍性結腸炎

［DOI］10. 3969 / j. issn. 2096-2266. 2016. 04. 005

潰瘍性結腸炎（Ulcerative colitis，UC）是炎癥性腸病中的一種，其發病機制尚未明確，可能與遺傳、免疫、感染、精神、心理等因素有關，主要表現為連續性、彌漫性黏膜和黏膜下炎性改變，形成肉眼可見的糜爛和潰瘍〔1〕。目前臨床常用氨基水楊酸、糖皮質激素及免疫抑制劑等藥物治療，西藥以美沙拉嗪應用最廣〔2〕，但長期服用會有耐受、胃腸反應等不良反應。UC根據臨床表現屬中醫的“便血”“泄瀉”“腸風”“臟毒”等范疇，我國自古就有治療“便血”和“泄瀉”的多種中藥藥方，中藥在治療急、慢性UC上也體現了不可比擬的優勢，其中康復新液具有促進機體創傷愈合、修復以及改善胃腸黏膜創面微循環，促進肉芽組織增生等療效，且在UC臨床治療中有廣泛的應用。UC病變可累及遠端結腸，直腸給藥是治療UC直接有效的方法。與口服給藥相比，直腸給藥全身性副作用較小，局部藥物濃度高，更有利于治療。本文采用康復新液灌腸方式對UC大鼠進行治療，以期觀察康復新液的療效，為進一步探討其抗UC的機制及臨床應用提供理論依據。

1　實驗材料

1.1實驗動物SPF級SD大鼠，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，雌雄各半，體重180～220 g，合格證號：SCXK（湘）2011-0003。

1.2藥品與試劑美沙拉嗪灌腸液（莎爾福）（批號：14J37，規格：60 g：4 g，德國福克制藥股份有限公司）；康復新液（美洲大蠊干燥蟲體提取物）（批號：150327，規格：100 mL，四川好醫生攀西藥業有限責任公司）。無水乙醇、丙酮、冰乙酸、甲醛、2，4-二硝基氯苯、異氟烷、水合氯醛、隱血試劑盒；大鼠白細胞介素-4（IL-4）試劑盒、大鼠IL-10試劑盒（批號：20151124，欣博盛生物科技有限公司）。

1.3儀器奧地利安圖斯2010酶標儀（奧地利安圖斯公司，型號：201）；醫學圖像分析系統（成都泰盟，BI-2000）；電子天平（梅特勒-托利多，EL-104）；電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司，HWS-24）。

2　實驗方法

2.1模型建立70只SPF級SD大鼠適應性飼養一周，挑選10只作正常對照組，剩余60只隨機分籠，做好標記后，大鼠背部脫毛，用2%2，4-二硝基氯苯（DNCB）的丙酮溶液滴于大鼠背部脫毛區，1次/d，每次0.3 mL/只，連續14 d，正常飲食飲水。第15天（大鼠禁食不禁水24 h），異氟烷麻醉，用直徑3.0 mm的尼龍導管經肛門插入8 cm處，注入0.1%DNCB乙醇（50%濃度）溶液0.25 mL/只，第16天同部位注入6%醋酸溶液0.7 mL，準確記時10 s后用3 mL生理鹽水沖洗，造成DNCB聯合醋酸誘導的慢性大鼠UC模型〔3〕。

2.2分組及實驗方法造模完成1周后，按照疾病活動指數（DAI）評分〔4〕分層，剔除極輕度炎癥模型大鼠（以0～3分極輕度炎癥、4～6分輕度炎癥、7～9分中度炎癥、10～12分重度炎癥分層），其余大鼠按炎癥嚴重程度分層后再隨機分為模型對照組（灌腸給予生理鹽水，2.50 mL/kg）；美沙拉嗪灌腸組（0.40 g/kg）；康復新高、中、低劑量灌腸組（3.00 mL/kg、1.50 mL/kg、0.75 mL/kg）5個組，正常對照組（灌腸給予生理鹽水，2.50 mL/kg），各組大鼠10只，雌雄各半。造模完成1周后開始給藥，1次/d，連續14 d。于造模結束后的第1、4、8、14、21天進行DAI評分，評分標準包括體質量下降百分比、糞便性狀、隱血測試。

末次給藥后第2天，將大鼠用10%水合氯醛溶液（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，腹主動脈取血、4℃靜置4 h后，3 500 r/min（4℃）離心10 min，取上清液并按試劑盒說明測定IL-4、IL-10含量；取大鼠肝臟、脾臟、胸腺稱重并計算臟器指數；取結腸測結腸長度、寬度和結腸濕重，將取出的結腸平鋪于白瓷板上，肉眼觀察結腸黏膜損傷情況，并進行結腸黏膜損傷評分（CMDI）（冰上操作），結腸放于10%中性福爾馬林中固定，常規石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察病理切片，并進行病理組織學評分（HS）〔5〕。

3　實驗結果

3.1康復新液對潰瘍性結腸炎大鼠DAI分值的影響

造模結束后多數大鼠出現大便隱血、腹瀉，但正常組大鼠活動、進食正常，無明顯體重減輕和腹瀉的現象，治療前，正常組與各造模組的DAI分值差異均有統計學意義（P＜0.01），各造模組組間DAI分值差異無統計學意義，治療期間各組的DAI評分隨給藥時間均有降低趨勢；第4天康復新液高劑量組的DAI評分與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05），第8、14、21天，模型組DAI明顯高于美沙拉嗪組和康復新液高、中、低劑量組，第21天美沙拉嗪組的DAI分值與正常組無異，且與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05），其次是康復新液高、中、低劑量組。見表1。

3.2康復新液對大鼠臟器指數的影響各組胸腺指數和脾臟指數差異無統計學意義，其中美沙拉嗪組對胸腺的免疫功能有抑制趨勢，而康復新液各組則顯示促進的趨勢；在肝臟指數中，康復新液各組的肝臟指數較模型組降低，其中中、低劑量組與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。康復新液各組均能降低結腸指數，減輕結腸黏膜水腫現象，其中高、中劑量組與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.01），并且高劑量組效果與美沙拉嗪組相當。見表2。

表1　康復新液對大鼠DAI分值的影響（n=10，±s）

表1　康復新液對大鼠DAI分值的影響（n=10，±s）

注：與正常組比較**P＜0.01；與模型組比較#P＜0.05，##P＜0.01；與美沙拉嗪組比較◆P＜0.05，◆◆P＜0.01。

組別　劑量DAI分值正常對照組模型對照組美沙拉嗪組康復新高劑量組康復新中劑量組康復新低劑量組——0.40 g/kg 3.00 mL/kg 1.50 mL/kg 0.75 mL/kg 1 d 0.00±0.00##◆◆7.50±0.71**7.50±1.58**7.60±1.26**7.60±1.26**7.80±1.23**4 d 0.10±0.32##◆◆6.40±2.17**5.90±1.37**4.80±1.87**#5.40±1.71**6.30±2.26**8 d 0.00±0.00##◆◆5.30±2.26**4.60±1.35**4.10±2.28**5.10±2.38**5.30±2.54**14 d 0.90±0.99##◆◆4.10±1.91**3.20±1.14**3.50±1.51**3.10±1.29**3.50±1.58**21 d 1.30±1.06##3.10±2.08**◆1.60±1.17#2.40±1.71**2.40±0.84**2.70±1.57**◆

表2　康復新液對大鼠臟器指數的影響（n=10，±s）

表2　康復新液對大鼠臟器指數的影響（n=10，±s）

注：與正常組比較**P＜0.01；與模型組比較#P＜0.05，##P＜0.01；與美沙拉嗪組比較◆P＜0.05，◆◆P＜0.01。

劑量組別正常對照組模型對照組美沙拉嗪組康復新高劑量組康復新中劑量組康復新低劑量組——0.40 g/kg 3.00 mL/kg 1.50 mL/kg 0.75 mL/kg胸腺指數/（mg/g）1.11±0.18 1.01±0.62 0.94±0.43 1.29±0.50 1.17±0.54 1.09±0.78脾臟指數/（mg/g）2.47±0.40 2.83±1.17 3.42±1.57 2.92±1.96 3.06±1.06 3.21±1.22肝臟指數/（mg/g）23.79±1.95##27.91±3.35**◆24.35±2.34#25.50±2.41 23.44±2.20##23.81±3.70##結腸指數/（mg/g）5.18±0.22##7.01±0.96**◆◆5.69±0.54##5.57±0.57##5.95±1.70#6.53±1.38**

3.3康復新對大鼠結腸長、寬及黏膜損傷評分的影響與正常組相比，模型組大鼠結腸變粗、長度明顯縮短；治療藥物組結腸長度較模型組長，其中康復新液高劑量組結腸最長（P＜0.01）。模型組的長寬比明顯小于正常組，美沙拉嗪組（P＜0.01）和康復新液各組（P＜0.05）更接近正常組。見表3。

正常組大鼠結腸形態正常，黏膜光滑平整，皺襞紋理清晰，腸壁未增厚，腸組織間無黏連，未見黏膜充血、水腫、糜爛及潰瘍等病變。與正常對照組比較，模型組結腸黏膜充血、水腫，中、重度腸壁增厚及有重度糜爛、潰瘍，潰瘍呈橢圓形，底部可見少量淡黃色覆蓋物，邊緣充血水腫，模型組結腸黏膜CMDI顯著升高（P＜0.01）；美沙拉嗪組與模型組比腸黏膜較光滑，輕度充血，無水腫，結腸黏膜損傷評分明顯低于模型組（P＜0.01），模型組與美沙拉嗪組的結果提示模型復制成功，可以用于評價受試藥物的療效。康復新液高、中、低劑量組可見少量充血水腫，部分結腸可見輕度糜爛或潰瘍，其中康復新液高、中劑量組與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3　康復新液對大鼠結腸的影響（n=10，±s）

表3　康復新液對大鼠結腸的影響（n=10，±s）

注：與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較#P＜0.05，##P＜0.01；與美沙拉嗪組比較◆P＜0.05，◆◆P＜0.01。

組別正常對照組模型對照組美沙拉嗪組康復新高劑量組康復新中劑量組康復新低劑量組劑量——0.40 g/kg 3.00 mL/kg 1.50 mL/kg 0.75 mL/kg結腸長度/cm 19.89±0.81##◆◆17.05±1.10**17.97±1.31**18.45±1.24*#17.32±1.27**17.15±2.05**長寬比/（cm/cm）25.00±2.07##◆17.99±3.98**◆◆22.02±4.41*##21.55±2.17*#21.56±4.18*#21.06±4.64**#CMDI 1.40±0.70##3.10±0.74**◆◆1.90±0.74##2.30±0.48*#2.40±0.87**2.60±1.10**

3.4康復新液對大鼠血清IL-4、IL-10含量的影響與正常組相比，模型組大鼠血清IL-4和IL-10的表達顯著降低（P＜0.01），與模型組比較，美沙拉嗪組和康復新液高、中、低劑量組大鼠血清IL-4和IL-10表達均有顯著升高（P＜0.01），其中康復新液高劑量組大鼠血清IL-4升高最多，見表4。

表4　康復新液對大鼠血清IL-4、IL-10含量的影響（n=10，±s）

表4　康復新液對大鼠血清IL-4、IL-10含量的影響（n=10，±s）

注：與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較##P＜0.01；與美沙拉嗪組比較◆P＜0.05，◆◆P＜0.01。

組別正常對照組模型對照組美沙拉嗪組康復新高劑量組康復新中劑量組康復新低劑量組劑量——0.40 g/kg 3.00 mL/kg 1.50 mL/kg 0.75 mL/kg IL-4/（pg/mL）48.46±6.21##24.01±3.84**◆◆41.47±4.22##45.54±3.62##38.91±5.42*##32.75±3.39**##◆IL-10/（pg/mL）58.34±5.88##19.30±4.99**◆◆54.15±7.53##50.78±7.61##45.10±5.71*##◆38.84±2.50**##◆◆

3.5康復新液對大鼠結腸組織HS的影響正常組大鼠結腸黏膜鏡下觀察組織形態正常，腸壁結構清晰，腺體分布均勻，未見充血、水腫、糜爛及潰瘍形成，間質少量淋巴細胞浸潤。模型組鏡下可見黏膜糜爛脫落、充血水腫，炎癥細胞浸潤，形成多個潰瘍缺損，病理組織學評分明顯高于正常組（P＜0.01）；美沙拉嗪組，康復新液高、中劑量組結腸黏膜潰瘍數目明顯減少，底部可見纖維結締組織增生，充血水腫明顯減輕，伴少量炎癥細胞浸潤，病理組織學評分明顯下降，具有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05），見表5及圖1。

表5　康復新液對大鼠結腸組織HS分值的影響（n=10，±s）

表5　康復新液對大鼠結腸組織HS分值的影響（n=10，±s）

注：與正常組比較**P＜0.01；與模型組比較#P＜0.05，##P＜0.01；與美沙拉嗪組比較◆P＜0.05，◆◆P＜0.01。

組別　劑量HS評分正常對照組模型對照組美沙拉嗪組康復新高劑量組康復新中劑量組康復新低劑量組——0.40 g/kg 3.00 mL/kg 1.50 mL/kg 0.75 mL/kg上皮細胞評分0.30±0.67##◆◆3.50±0.53**◆◆2.30±0.48**##2.60±0.52**#2.60±0.52**#2.90±0.74**炎細胞浸潤評分1.10±0.32##◆◆3.40±0.52**◆2.30±0.48**#2.60±0.52**#2.90±0.57**3.10±0.63**◆總分1.40±0.70##◆◆6.90±0.88**◆◆4.60±0.85**##5.20±0.63**#5.50±0.97**6.00±0.74**

圖1　康復新液對大鼠結腸病理組織的影響

4　討論

康復新液高、中、低劑量組均能在一定程度上降低UC大鼠的DAI評分、結腸指數，緩解結腸黏膜水腫現象，減輕炎癥、緩解黏膜水腫、修復潰瘍效果較優，美沙拉嗪、康復新液經灌腸給藥后能直接改善UC大鼠結腸組織病變程度，修復腸道損傷黏膜，減輕結腸的炎癥反應。因IL-4具有抑制炎癥的特性，臨床研究發現UC患者IL-4分泌量減少，其對炎癥反應的抑制作用減弱，自身免疫平衡遭到破壞，導致UC的發生發展〔6〕，實驗中模型組IL-4含量明顯降低，其變化趨勢與臨床相符。康復新液各組都有升高IL-4的趨勢，且高劑量組表達水平高于美沙拉嗪組接近正常組，表現出增強抑制炎癥的作用。而IL-10主要由Th2型細胞分泌，研究〔7〕表明，UC患者活動期的血清及黏膜組織的IL-10水平較正常對照組低，且和疾病嚴重程度有關。實驗中康復新液各組都能升高IL-10含量，其中高劑量組表達水平與美沙拉嗪相當。

UC的發病機制尚未完全明確，根據其臨床表現屬中醫的“便血”“泄瀉”“腸風”“臟毒”等范疇〔8〕。目前該病的臨床治療分為手術治療與非手術治療兩種〔9〕，但UC的治療總體以非手術治療為主，作為新一代的氨基水楊酸制劑美沙拉嗪由于療效確切而成為治療UC最常用的藥物〔10〕。本研究將臨床治療UC的中藥康復新液經灌腸治療UC大鼠，以美沙拉嗪作為陽性對照，觀察康復新液的治療效果，豐富了中藥灌腸治療UC的研究價值。研究表明康復新液具有祛腐生肌、改善胃腸黏膜創面微循環的作用，可加速機體病損組織修復再生，抑菌抗炎、消除水腫和增強機體免疫功能〔11〕。通過灌腸給藥，提高了局部藥物濃度，延長藥物在腸腔內停留時間，更能充分發揮康復新液的作用。康復新液可通過提高模型大鼠血清IL-4和IL-10表達水平，起到抑制炎癥的作用，而美沙拉嗪主要通過抑制前列腺素和白三烯的形成達到抗炎目的〔12〕，二者在對緩解UC的癥狀都體現了各自的效果和優勢，臨床治療中合理運用能優勢互補地提高和改善UC患者的生活質量。本文作者正開展康復新液抗UC大鼠的機制研究，為臨床中藥灌腸治療UC的應用提供依據。

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（責任編輯李楊）

Effect of Kangfuxin Solution to Ulcerative Colitis Rat Model Made by Treatment of 2，4-Dinitrochlorobenzene Combined with Acetic Acid

Wang Pengchuan1，2，3，He Miao1，2，Zhang Hanchao1，2，3，Li Guike1，2，4，Li Hui1，2，3，Zhang Chenggui1，2*
（1. Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D，Dali，Yunnan 671000，China；2. National-Local Joint Engineering Research Center of Entomoceutics，Dali，Yunnan 671000，China；3. College of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali，Yunnan 671000 China；4. Good Doctor Pharmaceutical Group，Chengdu 610000，China）

〔Abstract〕Objective: To explore the effect of Kangfuxin solution through enema adimistration to ulcerative colitis rat model，which was made by the treatment of 2，4-dinitrochlorobenzene combined with acetic acid. Methods: Ulcerative colitis rats were treated by enema adimistration. For evaluating the effect of Kangfuxin solution on ulcerative colitis rats，the damaged intestinal mucosa and pathological changes were observed through the determination of DAI，viscera index of rats，the expression level of serum IL-4 and IL-10. Results: It was showed that positive medicine mesalazine and Kangfuxin solution both can improve the UC rats colon tissue lesions，repair the damaged intestinal mucosa，decrease histologic grade markedly（P＜0.01 or P＜0.05）and the effect of enema is obvious. The different doses of Kangfuxin solution can reduce DAI score，colon index and inflammation，alleviate mucosal edema and enhance IL-4（P＜0.01）and IL-10（P＜0.01）expression level. The effect of alleviating mucosal edema and promoting healing of ulcer surface of Kangfuxin group was improved. Conclusion: Kangfuxin solution plays an active role in treating the inflammation of UC rats which is induced by 2，4-dinitrochlorobenzene and acetic acid，promoting the healing of UC rats colon ulcer and reducing the diarrhea of UC rats（DAI score lower）.

〔Key words〕Kangfuxin；mesalazine；enema；ulcerative colitis

［中圖分類號］R285

［文獻標志碼］A

［文章編號］2096-2266（2016）04-0017-05

［基金項目］國家自然科學基金資助項目（81360679）；云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室基金資助項目（2015DG030）

［收稿日期］2016-01-11［修回日期］2016-03-07

［作者簡介］王朋川，碩士研究生，主要從事潰瘍性結腸炎藥理學研究.

*通信作者：張成桂，副教授，博士.