分子標記輔助選擇改良三系雜交稻恢復系R225稻瘟病抗性

聶元元　李霞　毛凌華　顏滿蓮　顏龍安　蔡耀輝*

（1江西省超級水稻研究發展中心/國家水稻工程實驗室，南昌330200；2江西省農業科學院水稻研究所/國家水稻改良中心南昌分中心，南昌330200；*通訊作者）

?

分子標記輔助選擇改良三系雜交稻恢復系R225稻瘟病抗性

聶元元1李霞2毛凌華1顏滿蓮1顏龍安1蔡耀輝1*

（1江西省超級水稻研究發展中心/國家水稻工程實驗室，南昌330200；2江西省農業科學院水稻研究所/國家水稻改良中心南昌分中心，南昌330200；*通訊作者）

摘要：稻瘟病是水稻的主要病害，培育抗稻瘟病品種是防治稻瘟病的有效途徑。本研究通過分子標記輔助選擇與雜交育種相結合的方式，將稻瘟病抗性基因Pi1、Pi2和Pi9導入到三系雜交稻恢復系R225。對BC3F3代材料進行苗期和成熟期稻瘟病抗性鑒定，攜帶1個或2個抗性基因的目標株系抗性達到中抗以上水平，稻瘟病抗性顯著高于各自的輪回親本。SSR標記分析表明，改良株系的遺傳背景回復率達到86.1%～95.3%。通過標記輔助選擇獲得的改良材料為三系雜交稻恢復系的培育提供了稻瘟病抗性親本。

關鍵詞：標記輔助選擇；稻瘟病；三系雜交稻；恢復系

稻瘟病是由真菌Magnaporthe oryzae引起的水稻毀滅性病害，是水稻生產的主要病害，選育和應用抗病品種是防治稻瘟病、減少其危害的有效途徑［1］，同時也是保護環境、發展綠色水稻產業、實現水稻可持續性發展和確保糧食安全的迫切需要。然而，由于稻瘟菌小種的高度變異性，大面積推廣的水稻品種含有的抗性基因往往在3～5年之后就失去抗性，導入廣譜抗性基因和選育抗瘟性強的水稻品種是目前最常用的預防稻瘟病的方法［2］。

目前已標記定位的稻瘟病抗性基因達80多個，不同稻區稻瘟病的生理小種差異很大，因此，利用什么樣的抗病基因進行品種改良，也會因稻區的不同而不同。此外，用于雜交稻育種的基因必須具有較強的顯性作用。在本研究中選用的Pi1對我國792個稻瘟病小種的絕大部分表現抗性，其抗性頻率達89.65%，是一個廣譜的稻瘟病抗性基因［3］，利用RM224和MRG4766對Pi1選擇的準確率達100%［4］。Pi2也是一個廣譜抗性基因，對455個菲律賓小種及來自16個國家和地區的43個小種中的36個小種表現抗性，Zhou等［5］已克隆該基因。而Pi9基因來自小粒野生稻Oryza minuta，對所有供試菲律賓小種，來自16個國家和地區的43個小種表現抗性［6］，Qu等［7］已成功克隆了該基因。Pi2與Pi9是位于第6染色體著絲粒附近位置非常接近的抗病基因。

受體輪回親本R225是江西省超級水稻研究發展中心選育的優良恢復系，株型適中，分蘗力強，穗大粒多，結實率高，后期落色好。所配組合榮優225于2009年通過江西省審定，并被列為江西省晚秈主栽品種之一，2012年通過國家審定，2014年通過農業部超級稻認定，同時被列為農業部主導品種。榮優225已申請植物新品種保護，具有較好的應用前景［8］。本研究通過分子標記輔助選擇和回交育種的策略，利用攜帶稻瘟病抗性基因Pi1、Pi2基因的材料BL6與含Pi9基因的親本材料75-1-127分別與R225雜交，將Pi1、Pi2和Pi9基因聚合到優良恢復系R225中，以選育稻瘟病抗性增強的優良株系。

1　材料與方法

1.1試驗材料

以含有抗稻瘟病基因Pi1、Pi2的材料BL6和含有抗稻瘟病基因Pi9的材料75-1-127作為本試驗的供體，以恢復系R225為受體，通過雜交、回交和分子標記輔助選擇，建立回交BC1F1分離群體，同時分子標記檢測，選擇陽性植株與輪回親本R225回交，在回交后自交兩代獲得BC3F3，獲得含目標抗性基因的單株，每個世代均用分子標記進行目標基因選擇（圖1）。

1.2稻瘟病抗性鑒定

稻瘟病抗性鑒定采用大棚人工接種鑒定和井岡山稻瘟病自然鑒定。井岡山鑒定點是國家和省級區試水稻稻瘟病抗性鑒定點，溪溝縱橫，四面環山，屬典型的山陰梯田，日照時間短，霧露時間長，高溫高濕，極有利于稻瘟病的發生。

1.3抗性基因的分子標記檢測

采集水稻幼嫩葉片用CTAB法快速提取DNA［9］，引物由上海生工合成。選擇親本間擴增片段差異較大引物，用瓊脂糖凝膠電泳進行分子標記檢測。

圖1　分子標記輔助選擇聚合稻瘟病抗性基因Pi1、Pi2和Pi9

圖2　Pi1、Pi2和Pi9基因選擇標記RM144、AP22和PB8的分子標記檢測結果

2　結果與分析

2.1目標基因選擇的分子標記

分別合成RM144、RM224、MRG4766等3對與Pi1基因緊密連鎖標記的引物［10］，AP22、SRM24、Nbs2P3、RM527等4對與Pi2基因緊密連鎖及基因內標記的引物［11］，PB8和Nbs-Pi9等2對與Pi9基因緊密連鎖或基因內標記的引物［12］。通過PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳分子標記檢測，篩選本實驗中所涉及輪回親本R225和相應供體親本BL6、75-1-127間的多態性。根據篩選多態性結果，選擇瓊脂糖凝膠電泳可以檢測供體-受體間差異的標記，分別為RM144對Pi1基因，AP22對Pi2基因，PB8對Pi9基因進行標記輔助選擇（圖2）。

2.2 BC3F3改良材料的稻瘟病抗性表型鑒定

分子標記輔助選擇獲得聚合Pi1、Pi2及Pi9基因改良株系116株，聚合Pi1、Pi2基因改良株系327株。對受體、供體親本及改良株系在井岡山鑒定點進行稻瘟病抗性鑒定。苗期調查分級參照Tharreu D的6級統一標準將病斑分為6級，1～3級為抗病表型，4～6級為感病表型［13］。調查結果表明，輪回親本R225自然狀態下表現感病，抗病級別為5級；供體親本BL6自然狀態下表現抗病，抗病級別為1級，供體親本75-1-127自然狀態下表現抗病，抗病級別為1級；改良群體自然狀態下抗病級別為2～4級，其中聚合了Pi1、Pi2及Pi9基因的改良株系抗病效果得到明顯提高，抗病級別為1級，聚合了Pi1、Pi2基因的改良株系抗病效果也很明顯，抗病級別為1～2級。

成熟后期重點調查穗頸瘟。輪回親本R225自然狀態下表現感病，抗病級別為6級，穗頸瘟嚴重；供體親本BL6自然狀態下表現抗病，抗病級別為1級；供體親本75-1-127自然狀態下表現抗病，抗病級別為1級；改良群體自然狀態下抗病級別為3～4級，其中116株聚合了Pi1、Pi2及Pi9基因的改良株系中表現高抗的有21株，抗病級別為1級，其余95株表現抗病，但是也有少量單株出現穗頸瘟，抗病級別為2～3級；聚合了Pi1、Pi2基因的327株改良株系抗病級別為1～2級，其中96株表現高抗，抗病級別為1級。

對16份攜帶Pi1、Pi2及Pi9基因的BC3F3代改良材料進行稻瘟病抗性鑒定，調查材料包含R225/BL6、R225/75-1-127、R225/BL6//75-1-127等，每份材料調查30株。調查結果發現，R225表現為中感，抗病級別為4級；BL6表現為高抗，抗病級別為1級；75-1-127表現為高抗，抗病級別為1級；攜帶有抗性基因的改良株系則表現為抗及中抗水平，不含抗性基因的材料對稻瘟病表現為感病或中感（表1）。

2.3改良株系遺傳背景的SSR標記檢測

選取BC3F3代材料10個株系進行SSR背景分析，在R225與75-1-127中篩選到101對SSR多態性標記，在R225與BL6間篩選到114對SSR多態性標記，這些引物在水稻12對染色體上近似平均分布，檢測的單株標記基因型中輪回親本基因型的比率在86.1%～95.3%之間，改良株系遺傳背景近似輪回親本。

對獲得的BC3F3代材料進行田間農藝性狀調查，改良株系與相應輪回親本R225表型較為相似，改良材料在株型、株高、穗型和后期落色等性狀上與輪回親本表現基本一致。而部分性狀上有意識的傾向于選擇供體親本的性狀，以彌補輪回親本的一些缺點，例如，BL6來源的改良材料傾向于短圓粒，且谷殼顏色金黃的材料，而75-1-127來源的改良材料則分蘗力變強，生育期推遲3～5 d。

表1　改良后代株系及親本稻瘟病抗性鑒定結果

3　討論

隨著生物技術的發展，人們發現越來越多的稻瘟病抗性位點與抗性基因［14］。目前已標記定位的稻瘟病抗性基因達68個，其中23個被成功克隆，但不同稻區稻瘟病的生理小種差異很大，因此，利用什么樣的抗病基因進行品種改良，也會因稻區的不同而不同。此外，用于雜交稻育種的基因必須具有較強的顯性作用［15］。本研究選用具有廣譜抗性的稻瘟病抗性基因Pi1、Pi2 和Pi9作為目的基因，通過分子標記輔助選擇技術進行水稻抗稻瘟病基因聚合育種，利用與抗性基因緊密連鎖的SSR標記同時鑒定多個抗性基因的存在與否，同時結合田間表型鑒定稻瘟病抗性。

育種實踐證明，要育成具有廣譜抗性的雜交稻新組合，其雙親之一應具有廣譜抗性［16-17］。如福建省農科院水稻所育成稻瘟病抗性不育系地谷A、福伊A，以及利用其配組選育而成抗稻瘟病的雜交稻組合地優77、福優964、福優明86等，在武陵山區等稻瘟病重發區種植，表現出較強的稻瘟病抗性水平［18］。本研究通過分子標記輔助選擇聚合具有廣譜抗性的3個稻瘟病抗性基因，改良恢復系R225稻瘟病抗性，從而達到改良其雜交稻組合稻瘟病抗性的目的。

參考文獻

［1］Couch B C，Hohn L M. A multilocus gene genealogy concordan with host preference indicates segregation of a new species Magnaporthe oryzae，from M grisea［J］. Mycologia，2002，94: 683-693.

［2］Hittalmani S，Parco A，Mew T V，et al. Fine mapping and DNA marker-assisted pyramiding of the three major genes for blast resistance in rice［J］. Theor Appl Genet，2000，100: 1 121-1 128.

［3］Chen H L，Chen B T，Zhang D P，et al. Pathotypes of pyricularia grisea in rice fields of central and southern China［J］. Plant Disease，2001，85: 843-850.

［4］Mackill D J，Bonman J M. Inheritance of blast resistance in near-isogenic lines of rice［J］. Phytopathology，1992，82: 746-749.

［5］Zhou B，Qu S H，Liu G F，et al. The eight amino-acid differences within three leucine-rich repeats between Pi2 and Piz-t resistance proteins determine the resistance specificity to magnaporthe grisea ［J］. Mol Plant Microbe Interact，2006，19: 1 216-1 228.

［6］Liu G，Lu L，Zeng G L. Two broad-spectrum blast resistance genes，Pi9（t）and Pi2（t），are physically linked on rice chromosome 6［J］. Mol Genet Genomics，2002，267: 472-480.

［7］Qu S H，Liu G F，Zhou B，et al. The broad-spectrum blast resistance gene pi9 encodes a nucleotide -binding site -leucine -rich repeat protein and is a member of a multigene family in rice［J］. Genetics，2006，172: 1901-1914.

［8］聶元元，毛凌華，李永輝，等.三系雜交晚稻榮優225示范推廣的現狀與展望［J］.雜交水稻，2014，29（2）：37-39.

［9］樓巧君，陳亮，羅利軍.三種水稻基因組DNA快速提取方法的比較［J］.分子植物育種，2005，3（5）：749-752.

［10］陳志偉，官華忠，吳為人，等.稻瘟病抗性基因Pi-1連鎖SSR標記的篩選和應用［J］.福建農林大學學報，2005，34（1）：74-77.

［11］陳志偉，鄭燕，吳為人，等.抗稻瘟病基因Pi-2（t）緊密連鎖的SSR標記的篩選與應用，分子植物育種，2004，2（3）：321-325.

［12］劉士平，李信，汪朝陽，等.基因聚合對水稻稻瘟病的抗性影響［J］.分子植物育種，2003，1（1）：22-26.

［13］Tharreau D，Lebrun M H，Talbot N J，et al. New tools for resistance gene characterization in rice［G］. In: Advances in Rice Blast Re-search. Proceedings of the 2nd International Rice Blast Conference. Montpellier，France，1998，Kluwer Academic Publishers，Wageningen，The Netherlands，2000: 54-62.

［14］安正帥，劉國蘭，梅捍衛，等.標記輔助改良節水抗旱雜交稻親本材料的稻瘟病抗性［J］.分子植物育種，2010，8（6）：1 172-1 176.

［15］卓偉，許旭明，張受剛，等.抗稻瘟病秈型水稻不育系廣抗13A的選育［J］.雜交水稻，2009，24（2）：10-13.

［16］肖葉青，胡蘭香，吳小燕，等.野敗型不育系“贛香A”的稻瘟病抗性研究［J］.分子植物育種，2010，8（6）：1 102-1 107.

［17］劉毅，王加紅，黎良通，等.分子標記輔助選擇Xa23基因改良節水抗旱稻親本的白葉枯病抗性研究［J］.上海農業學報，2014，30 （1）：13-16.

［18］張建福，凌忠專，王國英，等.秈型恢復系云恢290稻瘟病抗性遺傳學分析［J］.分子植物育種，2006，4（4）：540-544.

Improving Blast Resistance of Parental Restorer Lines R225 by Marker-assisted Selection

NIE Yuanyuan1，LI Xia2，MAO Linghua1，YAN Manlian1，YAN Longan1，CAI Yaohui1*
（1Jiangxi Super-rice Research and Development Center/National Engineering Laboratory for Rice，Nanchang 330200，China；2Rice Research Institute，Jiangxi Academy of Agricultural Sciences/Nanchang Branch of Chinese National Center for Rice Improvement，Nanchang 330200，China；*Corresponding author）

Abstract:Rice blast is one of the most devastating diseases in rice. Cultivating rice blast resistant varieties is an effective way to control rice blast. Using marker assisted selection and backcrossing，blast resistance genes Pi1，Pi2 and Pi9 were introgressed into restorer parental lines R225. The BC3F3progenies harboring Pi1，Pi2 or Pi9 were selected by linked markers. The lines carrying one or two target genes are significantly higher than their respective recurrent parent. Background SSR analysis showed that the recovery rate of the target lines reached 86.1%～95.3%. The improved lines can be used as candidate parental lines for rice breeding with blast resistance.

Key words:marker-assisted selection（MAS）；rice blast；three line hybrid rice；restorer line

中圖分類號：S511.03

文獻標識碼：B

文章編號：1006-8082（2016）03-0060-04

收稿日期：2015-12-11

基金項目：“863”計劃“綠色性狀基因聚合與種質創新”（2014AA10A603）；江西省農科院青年基金（2014CQN 001）