耐苯巴比妥鈉及苯妥英鈉杏仁核點燃大鼠癲癇模型的制作*

唐太峰, 伍國鋒

(1.貴陽市第二人民醫院 神經內科， 貴州 貴陽　550081； 2.貴州醫科大學附院 神經內科， 貴州 貴陽　550004)

耐苯巴比妥鈉及苯妥英鈉杏仁核點燃大鼠癲癇模型的制作*

唐太峰1, 伍國鋒2

(1.貴陽市第二人民醫院 神經內科， 貴州 貴陽550081； 2.貴州醫科大學附院 神經內科， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 建立耐苯巴比妥鈉(PB)及苯妥英鈉(PHT)的杏仁核點燃癲癇模型大鼠的方法。方法： 60只雄性健康SD大鼠制作杏仁核點燃癲癇模型，采用PHT、PB對癲癇大鼠進行耐藥篩選，用放電閾值(ADT)來判斷癲癇大鼠對PHT和PB的敏感性，以應用PHT或PB前的ADT值為對照(對照值ADT)，用藥后ADT波動范圍在20%對照值ADT以內為耐藥癲癇模型判斷標準。結果： 60只大鼠，死亡13只，47只大鼠完成杏仁核點燃實驗，點燃癲癇模型大鼠24只，發作強度4～5級，癲癇點燃率51%；PB及PHT篩選出7只耐藥的癲癇大鼠，耐藥率29.17%；耐藥大鼠用藥后仍可誘發癲癇發作，用藥后ADT波動在20%對照值ADT之內。結論： 利用杏仁核慢點燃癲癇模型大鼠建立的耐藥癲癇模型可建立耐藥癲癇模型。

[關鍵詞]癲癇; 大鼠，SD; 動物模型； 杏仁核點燃; 耐藥; 苯妥英鈉; 苯巴比妥鈉

癲癇是一種神經系統的常見病, 發病率占總人口的1%～2%，目前仍以藥物治療為主。盡管治療癲癇的新藥不斷開發應用，但仍有部分患者對藥物的反應效果不佳，出現抗癲癇藥物(AEDs)耐藥的病例，且機制不明。對癲癇耐藥的研究，主要依賴于動物模型，癲癇模型制作主要有化學點燃和電點燃兩種方法，前者以藥物誘導癲癇發作，但易于被AEDs控制，故不適合建立耐藥癲癇模型；而后者與人類癲癇癥狀學、行為缺陷、對AEDs的反應等方面均很相似，較化學點燃模型更為理想。本研究以電點燃模型為基礎，并參照2015年耐藥癲癇定義[1]，探討建立理想耐藥癲癇模型的方法。

1材料和方法

1.1動物與儀器

雄性SD大鼠60只，平均體質量(200±50)g，購自貴州醫科大學動物實驗動物中心。大鼠分籠單獨飼養，飼養室安靜，保持溫度為(20±2)℃，相對濕度60%，光照時間12 h/d，清潔飲水，標準飼養。 主要儀器有BL-420E生物技能實驗系統，江灣Ⅱ型腦立體定位儀。

1.2方法

1.2.1刺激電極制備及電極定位將2根直徑0.2 mm鎳鉻漆包線截取適當的長度擰為螺旋狀，連接至微型插頭，用萬用表檢測線路連通且無短路，電極長度8.5 mm；4%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，固定于大鼠腦立體定位儀，暴露顱骨及前囟，剝離骨膜，創面止血及骨面干燥，在右側杏仁基底外側核的顱骨表面投射點鉆孔，按G paxinos 大鼠腦立體定位圖譜定位 (前囟后2.0 mm，矢狀縫旁開5.0 mm，深度8.5 mm)，將制備好的雙極螺旋鎳鉻電極垂直插入，以502膠水及牙托粉固定于顱骨表面。術后連續3 d腹腔注射青霉素鈉(100 000 U/d)預防感染，大鼠術后恢復1周開始電刺激。

1.2.2點燃癲癇模型和記錄腦電圖每日予杏仁核1次電刺激(細電流，串刺激，波寬1 ms，頻率60 Hz，持續時間1 s，強度0.450 mA)，同時記錄后發放(after discharge ，AD，即電刺激后高幅多棘波，確認5個以上)；對有AD及抽搐反應大鼠繼續每日給予刺激，同時觀察發作后的發作強度；對無AD及抽搐大鼠放棄刺激。癲癇發作強度按Racine法分級(表1)，連續3次4～5級以上發作則記為完全點燃，之后不再給予刺激；連續刺激30次以上，仍未達到4～5級發作，或雖曾達到4～5級，但以后發作等級逐漸倒退，則放棄刺激。對癲癇點燃的大鼠，于點燃24 h后測后放電閾值(after discharge threshold， ADT)，ADT是指能引起后發放的最小的電流強度，起始強度定為0.02 mA，此后按每次疊加20%刺激，每5 min記錄1次，直至測出后放電波，同時記錄腦電圖。

表1　杏仁核點燃癲癇模型癲癇發作Racine’s分級

1.2.3藥物篩選耐藥癲癇模型確定點燃ADT 24 h后，按1.2.2項下方法測定ADT對照值，按苯妥英鈉(PHT)75 mg/kg計算注射液體積，以等體積生理鹽水腹腔注射，注射后1 h測ADT，起始電流強度為點燃ADT值20%； 24 h后腹腔注射PHT (75 mg/kg)，注射后1 h測ADT(起始電流強度為ADT對照值的20%)；上述步驟連續3次，每次間隔1周。然后用同樣方法進行耐25 mg/kg苯巴比妥鈉(PB)耐藥篩選。耐藥判定根據Loscher[2]的評定方法，將ADT對照值與注射PHT或PB后所測得的ADT值對比，若連續3次注射PHT或PB后ADT值在ADT對照值的20%內，且電刺激仍可引起癲癇發作，則判定耐藥。

2結果

2.1癲癇模型大鼠點燃情況

60只大鼠，2只置入電極時死亡、3只置入電極1 d后死亡、2只置入電極后3 d后死亡，余下53只給予電刺激，刺激過程中電極脫落6只，最終47只完成點燃過程；成功點燃24只，成功率51%，平均發作天數15 d；模型大鼠癲癇典型發作時，開始出現凝視、點頭、眨眼及頸部抽搐甚至全身痙攣，然后雙上肢逐漸上抬、直立、跌倒以及全身性強直痙攣發作；其中1只大鼠偶爾有自發性發作，最長持續時間約15 min。刺激過程中還發現，在上一次電刺激引起的AD結束、切換電流方向給予閾下刺激時，還可引出AD或癲癇發作；但上一次電刺激引起的AD結束較長時間以后，用同一方向和強度的電流給予刺激，則不能引出AD或癲癇發作。

2.2腦電圖

癲癇點燃大鼠癲癇未發作時的腦電圖以散在的α、θ波為主要表現，AD時腦電圖主要表現為單個棘波、類棘慢波、多棘波活動，發作時腦電圖主要表現為大量高波幅棘波、尖波發放，夾雜棘慢復合波(圖1)。

注：a為未發作時腦電圖，b為AD時腦電圖，c為癲癇發作時腦電圖圖1　杏仁核點燃癲癇大鼠腦電圖Fig.1　EEG in rats of each period

2.3行為學表現

電刺激過程中，予大于ADT的電流強度刺激后，癲癇點燃大鼠明顯比未刺激及ADT閾下刺激時表現為煩躁，不易抓獲、逃竄、嘶叫， 2只出現撕咬，其中1只發生跳躍攻擊；同步腦電圖記錄可見AD，隨著大鼠逐漸安靜，腦電圖轉為平穩。

2.4藥物篩選

24只點燃大鼠，應用PHT 3次后，7只通過篩選，ADT值不增高或增高小于20%，且予電刺激后仍可引起癲癇發作； 接著應用PB 3次，7只大鼠全部通過篩選，確定為耐藥癲癇大鼠模型，耐藥率29.17%。

3討論

適宜模型的選擇是研究癲癇的重要前提。目前癲癇模型主要有遺傳模型、化學點燃模型和電點燃模型3類，其中遺傳模型因制作復雜且費用昂貴，難以實施，故目前應用最多的為化學點燃模型和電點燃模型，對于普通癲癇的研究，2者均能很好的完成，但對于以何種模型為基礎建立耐藥癲癇模型更為理想，目前研究尚少，這也是本實驗要探討解決的問題?；瘜W點燃模型種類繁多，常用致癇劑有青霉素、海人酸、匹魯卡品、馬錢子堿、戊四氮、美解眠、荷包牡丹堿、印防己毒素等，目前應用最多的耐藥性癲癇動物模型是匹魯卡品和海人酸模型。化學類模型制作簡單方便，且點燃成功率高，可達73%～96%[2-4]。但若作為篩選耐藥癲癇的模型，具有發作易于被抗癲癇藥物控制；隨著時間的推移，癲癇發作行為表現會逐漸倒退[5],不利于長期研究；缺乏可量化的評判指標等缺陷。此外，目前許多耐藥癲癇模型只選用一種AEDs進行耐藥篩選，而根據耐藥癲癇定義的核心[1]，至少對兩種或兩種以上AEDs耐藥才可稱為耐藥癲癇，故僅用一種AEDs篩選出的耐藥模型有所缺陷。

本研究認為理想的耐藥癲癇模型應具有以下標準:(1)兩種或兩種以上AEDs不能控制其癲癇發作；(2)發作類型及對AEDs的反應與人類相似;(3)模型發作時有腦部異常放電，可從電生理角度評價藥物療效；(4)模型穩定且能夠長期存活，有利于進行長期研究。而結果表明，電點燃模型篩選出的耐藥癲癇模型可很好的符合上述標準。電點燃模型是近來研究的熱點，腦內許多部位給予適當電刺激均可引起點燃現象，最經典和常用的是海馬和杏仁核，尤以杏仁核敏感性最高[6]。根據刺激方式的不同，電點燃可分為快點燃和慢點燃兩種?？禳c燃，成功率相仿，快點燃時間短，1 d～數d，而本研究所用的慢點燃平均點燃天數15 d。雖然快點燃模型制作更為方便快捷，但是對于研究耐藥癲癇來說，仍有其缺陷：(1)發作等級會隨時間推移而倒退[5]；(2)病生理改變與慢性癲癇模型有所區別，這提示慢點燃模型較快點燃模型可能更為符合人類的病理生理學改變。并且，慢電點燃模型，一經點燃，穩定性好、持續時間長，短期內不會出現明顯的發作等級倒退[7]。相對于化學點燃模型，電點燃模型除了觀察發作行為學的改變外，還可根據腦電圖、ADT這樣可量化的指標來觀察發作時的電生理變化，并且可據此進行更為可靠的藥物篩選，方便研究。本研究中，采用兩種不同作用機制的AEDs進行藥物篩選，更加符合臨床情況，未出現化學點燃模型中發作易被PB控制的情況；通過觀察ADT這一敏感且可量化的指標，能更加直觀、客觀地進行耐藥篩選。本實驗耐藥率29.17%，與人類患者中的30%左右的耐藥率相當[8]，符合臨床特點。本方法的缺陷主要在于，相對于化學點燃模型，此方法制作過程較為復雜，且50%左右的點燃率相對較低。

綜上所述，本研究通過慢電點燃建立的耐藥癲癇模型，相較于其他點燃方法，更為符合耐藥癲癇模型所應具有的特點，可更好地進行耐藥癲癇的相關研究。

4參考文獻

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(2016-03-26收稿，2016-05-12修回)

中文編輯： 潘婭； 英文編輯： 劉華

Construction of Amygdala Kindling Epilepsy Rat Model Resistant to Phenobarbital and Phenytoin Sodium

TANG Taifeng1, WU Guofeng2

(1.DepartmentofNeurology,theSecondPeople'sHospitalofGuiyang,Guiyang550081,Guizhou,China; 2.DepartmentofNeurology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To explore the way for construction of the amygdala kindling epilepsy rat model resistant to phenobarbital (PB) and phenytoin sodium(PHT). Methods: 60 healthy male SD rats were selected to make the amygdala kindling epilepsy model. Amygdala kindling rats were screened by PHT and PB for their drug resistance. After discharge threshold (ADT) was used to estimate their sensitivity to PHT and PB. The criterion of drug resistance epilepsy model was based on the variations of ADT: ADT fluctuation range under 20% of ADT control value. Results: Among the 60 rats, 13 died and 47 rats completed the amygdala kindling experiment. 24 rats were successfully established into amygdala kindling epilepsy rat model, attack intensity 4～5 level and epilepsy kindling rate was 51%. 7 rats with tolerance to phenobarbital sodium (PB) and phenytoin sodium(PHT) were picked, and resistant rate 29.17%. Drug resistant rats could still be induced to seizure of epilepsy, and ADT fluctuation range was under 20% of ADT control value. Conclusion: The amygdala kindling epilepsy rat model with tolerance to phenobarbital sodium (PB) and phenytoin sodium(PHT) can be successfully established.

[Key words]epilepsy; rat，Sprague-Dawley; animal model; amygdala kindling; drug resistance; phenytoin sodium; phenobarbital

[中圖分類號]R749.16

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)06-0671-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.012

網絡出版時間：2016-06-16網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160616.1727.052.html