貴州省黔西南地區苗族與漢族心房顫動患者KCNE1-S38G單核苷酸多態性研究*

胡　睿, 李　偉, 羅振華, 王朝富, 李騰龍, 吳立榮*

(1.貴州醫科大學附院 心血管內科, 貴州 貴陽　550004； 2.貴州省人民醫院 中心實驗室， 貴州 貴陽　550002； 3.興義市人民醫院， 貴州 興義　562400； 4.黔東南州人民醫院， 貴州 凱里　556000)

貴州省黔西南地區苗族與漢族心房顫動患者KCNE1-S38G單核苷酸多態性研究*

胡睿1**, 李偉1, 羅振華2, 王朝富3, 李騰龍4, 吳立榮1***

(1.貴州醫科大學附院 心血管內科, 貴州 貴陽550004； 2.貴州省人民醫院 中心實驗室， 貴州 貴陽550002； 3.興義市人民醫院， 貴州 興義562400； 4.黔東南州人民醫院， 貴州 凱里556000)

[摘要]目的： 探討貴州黔西南苗族和漢族心房顫動(AF)患者與鉀離子通道基因(KCNE1-S38G)單核苷酸多態性的關系。方法： 135例黔西南地區AF患者，按民族分為苗族組(50例)和漢族組(85例)，組內再按性別分組；將兩組患者年齡、性別、高血壓、血糖、冠心病、左房內徑、左室射血分數、吸煙、飲酒納入AF危險因素分析；采用聚合酶鏈反應和限制性內切酶片段長度多態性方法研究苗族和漢族患者KCNE1-S38G基因型及等位基因頻率，比較兩組不同性別AF患者的KCNE1-S38G基因型及等位基因頻率分布。結果： 苗族組AF患者發病年齡、高血壓發病率、飲酒率、左房內徑值低于漢族組，而左室射血分數高于漢族組 (P<0.05)；苗族組AF患者基因型頻率以SS為主，漢族以SG為主，等位基因均以S為主；兩組患者基因型頻率、等位基因頻率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；組內按性別分組，苗族組女性和男性患者KCNE1-S38G基因型以SS型為主，漢族組以SG型為主；兩組女性和男性患者等位基因以S為主，組內基因型和等位基因頻率按性別比較，差異無統計學意義(P>0.05)。結論: 貴州黔西南地區苗族和漢族AF患者KCNE1-S38G基因型和等位基因分布頻率存在差異，差異不受男女性別影響。

[關鍵詞]苗族； 心房顫動； 鉀離子通道基因； 單核苷酸多態性； 漢族

心房顫動(atrial fibrillation，AF)，是臨床上最常見的心律失常，其發病率逐年增高且趨向老齡化。我國AF總發病率為0.77%，男性高于女性，在全球共有3 350萬人患有AF，占世界人口的0.5%，對患者殘疾和死亡產生巨大影響[1-3]。AF的發生機制至今尚未完全明確。有研究發現心房肌細胞離子通道基因多態性可增強或減弱心房肌細胞的離子電流，而促進AF的發生。現已發現與AF相關的基因至少有25個，依據全基因組關聯性研究 (genome-wide association studies, GWAS)顯示的9個AF相關易感基因中，尤以心房肌鉀離子通道β亞基的KCNE基因家族中KCNE1為代表[4-5]，研究結果還表明KCNE1的多態性位點S38G在不同種族及不同區域存在差異[6-9]。本研究對貴州黔西南地區苗族與漢族AF患者KCNE1-S38G基因型及等位基因分布特點進行分析，報告如下。

1對象與方法

1.1對象

2012年9月～2014年12月心血管內科病房明確診斷為AF的患者135例，均來自貴州黔西南地區，其中苗族50例，漢族85例；排除并發瓣膜性心臟病、甲狀腺功能減退、甲狀腺功能亢進、慢性肺心病、先天性心臟病、經冠狀動脈旁路搭橋及導管射頻消融術后患者。將患者年齡、性別、高血壓、血糖、冠心病、左房內徑、左室射血分數、吸煙、飲酒納入AF危險因素分析。吸煙定義為平均每天至少吸1支煙，連續吸煙至少1年以上。飲酒定義為每周至少1次飲白酒100 mL，持續1年以上。

1.2方法

1.2.1DNA提取與引物設計抽取空腹外周靜脈血2 mL，應用美國OMEGA公司提供的E.Z.N.A.TM Blood DNA Midi Kit提取DNA，-80 ℃冰箱儲存備用。KCNE1-S38G擴增引物參考文獻[10-11]由上海生物技術有限公司合成，上游序列為5′-TGT GGC AGG AGA CAG TTC AG-3′，下游序列為5′-GCT TCT TGG AGC GGA TGT AG-3′。

1.2.2聚合酶鏈反應PCR反應體系(20 μL)，2×Easy Taq?PCR Super Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，模版DNA 3 μL，雙蒸水6 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s、53.5 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，30次循環，72 ℃延伸5 min。以雙蒸水替代DNA作為陰性對照。

1.2.3酶切鑒定KCNE1-S38G基因型采用MspA1I限制性內切酶，酶切體系(20 μL)：PCR反應產物10 μL，內切酶 0.5 μL/5 U，10×Buffer 2 μL，補雙蒸水致20 μL體系。酶切反應：37 ℃水浴過夜16 h。將酶切產物在120 V電壓下 2.0%的瓊脂糖凝膠上電泳45 min后觀察結果。KCNE1-S38G PCR產物長度為165 bp，酶切后基因型為GG的，僅有164 bp一條帶；基因型為SG型，則有71 bp，93 bp及164 bp三條帶；為SS型，會出現71 bp及93 bp兩條帶。

1.3統計學方法

2結果

2．1臨床資料

苗族組AF患者發病年齡、高血壓發病率、飲酒率、左房內徑值低于漢族組，而左室射血分數高于漢族組，差異有統計學意義(P<0.05)。表1。

表1　兩組AF患者臨床資料比較

2.2Hardy- Weinberg平衡檢驗

苗族組與漢族組KCNE1-S38G各基因型頻率經χ2檢驗觀察數與期望數，苗族組(χ2=5.930，P=0.052)，漢族組(χ2=0.250，P=0.882)，差異無統計學意義(P>0.05),說明兩組基因遺傳平衡, 數據來自同一孟德爾群體，具有群體代表性。

2.3MspA1I酶切產物電泳結果

從電泳圖中可知1、2為GG型，僅有164 bp一條帶；3、4為SG型，有71 bp、93 bp及164 bp三條帶；5、6及7為SS型，有71 bp及93 bp兩條帶。見圖1。

圖1　MspA1I酶切產物電泳結果Fig.1　Identification of KCNE1-S38G genotype

2.4KCNE1-S38G基因型和等位基因頻率分布

苗族組AF患者基因型頻率以SS為主，漢族以SG為主，兩組患者基因型頻率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；等位基因均以S為主，等位基因頻率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。兩組AF患者組內再按性別分組，苗族組女性和男性患者KCNE1-S38G基因型以SS型為主，漢族組以SG型為主；兩組女性和男性患者等位基因以S為主；組內基因型和等位基因頻率按性別比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表2　兩組AF患者KCNE1-S38G基因型及等位基因頻率比較(n，%)

表3　苗族組和漢族組AF患者KCNE1-S38G基因型及等位基因分布頻率與性別的關系(n,%)

3討論

AF的發生和維持主要涉及AF的基質(Substrate)、AF的觸發因素(Trigger) 及基因多態性。 KCNE1基因位于人類21號染色體，全長65 588 bp(PUBMED：NC-000021.9 GI:56881557)，在心肌細胞全長408 bp，KCNE1編碼的MinK蛋白由129個氨基酸組成，此蛋白編碼區域無內含子存在，其參與構成心臟慢激活電壓門控鉀離子通道(IKS通道) 的β亞單位；在心肌動作電位復極期起重要作用。這一發病機制在Lai等[12]的4個LQTS患者的研究中證實外顯子區域存在112 A→G點突變(A112G)，導致編碼蛋白的38位絲氨基S變為甘氨基G，能影響細胞動作電位的復極期電流，成為發病基礎。KCNE1的多態性位點S38G存在不同種族、區域的差異性，KCNE1的多態性位點S38G在新疆地區漢族人群中、中國華東地區漢族人群中與AF的發生無關，在維吾爾族人群中、中國臺灣人群與AF的發生有關[6-9]。

此次在采集的貴州黔西南地區苗族與漢族AF患者的研究中提示，苗族組KCNE1-S38G等位基因S頻率(82.7%)高于漢族組(68.2%)，等位基因G頻率(17.3%)低于漢族組(31.8%)，與Lai等[6]以臺灣人群為研究對象的AF患者以等位基因38G為主的結果比較。在貴州黔西南地區人群中少數民族AF患者以等位基因38S為主，結果不一致，不排除與貴州屬于云貴高原及西部不發達地區，以及特有的少數民族，而形成的生活方式與飲食習慣不同有關。與樓盛，毛婷等[8-9]研究結論基因型苗族以純合子為主，漢族以雜合子為主的結論一致，與Joachim等[13]的研究結論一致，等位基因38S 在LQTS 中比等位基因38G 更加明顯的延長IKS 電流，間接的促進AF的發生，進一步證實KCNE1-S38G基因型及等位基因分布頻率在不同民族中存在差異性。兩組患者基因型和等位基因分布頻率經性別區分后，分別在苗族組和漢族組中比較，提示苗族組男性女性均以SS 基因型為主，等位基因S為主，漢族組男性女性均以SG 基因型為主，等位基因S 為主，兩組患者基因型及等位基因分布頻率在性別中比較無統計學差異(P>0.05)，提示在采集的貴州黔西南地區AF患者中，苗族與漢族的KCNE1-S38G 基因型及等位基因分布頻率不受性別影響。這可能與人類具有99%的基因相同特征，1%的基因差異有關，因為這1%的基因差異導致了生命的多樣性即不同的種族、膚色、相貌、對各類疾病不同的敏感性以及對藥物的不同反應，也就說明不同種族同一基因的基因突變差異很大。其次通過對兩組患者臨床資料進行分析，顯示兩組患者平均發病年齡都超過了60歲，與報道結果一致，AF患者發病越來越趨向老齡化[2]。但少數民族患者發病年齡平均比漢族AF患者年輕5歲，其飲酒率、高血壓發生率和左房內徑值均低于漢族組，而左室射血分數值高于漢族組，考慮其原因可能與心臟功能以及高血壓發病率有關，與報道一致[14-15]。高血壓、年齡都是AF患者的高危因素，但未有報道有高血壓患者，比無高血壓患者的發病年齡會增加一個階段(如果以5歲為一個年齡分段)。由此可知，好的飲食習慣及生活方式，可適當減少AF患者的發生率和發病率。

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(2016-03-12收稿，2016-05-27修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 劉華

Analysis of Single Nucleotide Polymorphism of KCNE1-S38G of Patients with Atrial Fibrillation of Miao and Han People in Southwest of Guizhou

HU Rui1, LI Wei1, LUO Zhenhua2, WANG Zhaofu3, LI Tenglong4, WU Lirong1

(1DepartmentofCardiology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.Centrallaboratory,GuizhouProvincialPeople'sHospital,Guiyang550002,Guizhou,China；3.People'sHospitalofXingyi,Xingyi562400,Guizhou,China; 4.People'sHospitalofQiandongnan,Kaili556000,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To explore the association between atrial fibrillation (AF) and single nucleotide polymorphism(SNP) of KCNE1-S38G in minority and Han people of Southwest in Guizhou. Methods: 135 cases of patients with AF were divided into Miao group and Han group, and in Miao and Han group the patients were divided into male group and female group. The age, sex, hypertension, blood sugar, coronary heart disease, left atrial diameter, left ventricular ejection fraction, smoking, alcohol drinking of 2 groups of patients were included into the AF risk factors analysis. PCR and restriction endonuclease fragment length polymorphism (PCR-RFLP) were adopted to analyze KCNE1-S38G gene type and allele frequencies in Miao and Han people, and KCNE1-S38G gene type and allele frequencies distribution of AF patients of different sex were compared. Results: In Miao people, the age at onset, incidence of hypertension, rate of alcohol drinking and left atrial diameter were significantly lower than their counterparts in Han people while left ventricular ejection fraction of Miao people was significantly higher than that of Hans people(P<0.05). In Miao people, KCNE1-S38G genotype frequency were mainly SS while in Han people mainly SG. Allele frequencies were mainly S in Miao and Han AF patients. There were statistically significant differences in KCNE1-S38G genotype frequency and allele frequency between Miao and Han AF patients (P<0.05). In male and female of Miao AF patients, KCNE1-S38G genotype frequencies were mainly SS while in male and female of Han AF patients mainly SG. Allele frequencies in male and female of both Miao and Han AF patients were mainly S. There were no statistically significant differences in KCNE1-S38G genotype frequency and allele frequency between male and female of both Miao and Han AF patients (P>0.05). Conclusions: Differences can be found in distribution of KCNE1-S38G genotype and allele frequency between Miao and Hans AF patients in Southwest of Guizhou, and the differences are not affected by gender.

[Key words]Miao minority; atrial fibrillation; potassium ion channel gene; single nucleotide polymorphism; Han nationality

*[基金項目]貴州省優秀科技教育人才省長基金(2011-27)； 貴州省科技廳社會發展公關基金[黔科合SY字(2012)3113]； 貴州省科技廳聯合基金[黔科合LG字(2011)031]

[中圖分類號]R541.75； RZ273

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)06-0660-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.009

**貴州醫科大學2012級碩士研究生，現在廣東省第二人民醫院工作

***通信作者 E-mail:wlr@medmail.com.cn

網絡出版時間：2016-06-16網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160616.1710.038.html