短發(fā)夾RNA干擾CXCR4表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡及侵襲能力的影響*

賴　靖, 訾　聃, 楊英捷

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽　550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院, 貴州 貴陽　550004； 3.貴州省腫瘤醫(yī)院, 貴州 貴陽　550004)

短發(fā)夾RNA干擾CXCR4表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡及侵襲能力的影響*

賴靖1, 訾聃2**, 楊英捷3

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院, 貴州 貴陽550004； 3.貴州省腫瘤醫(yī)院, 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 探討短發(fā)夾RNA(shRNA)干擾趨化因子受體4(CXCR4)表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3侵襲能力及細(xì)胞凋亡的影響。方法： 將帶有綠色熒光蛋白的慢病毒載體轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，設(shè)計(jì)特異shRNA將其連入慢病毒載體；測(cè)序及熒光顯微鏡下觀察綠色熒光驗(yàn)證慢病毒載體構(gòu)建并轉(zhuǎn)染，利用RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株中CXCR4的mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株中CXCR4、促凋亡蛋白Bax、B細(xì)胞白血病-2基因(Bcl-2)、Bcl-xl及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的蛋白表達(dá)；Annexin V/PE雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞凋亡率，Transwell小室檢測(cè)轉(zhuǎn)染后卵巢癌細(xì)胞株SKOV3的侵襲力。結(jié)果： 測(cè)序結(jié)果及微下見綠色熒光蛋白表達(dá)，證實(shí)成功構(gòu)建慢病毒載體并轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，成功將特異shCXCR4連入載體；shCXCR4組mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯低于NC組(P<0.05)；干擾細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)能提高SKOV3細(xì)胞中Bax及Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)量，降低Bcl-xl與Bcl-2的蛋白表達(dá)，干擾后，SKOV3細(xì)胞凋亡率，shCXCR4組細(xì)胞凋亡率較CON組和NC組明顯增高(P<0.05)；穿膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少，抑制率為58.94%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論： 慢病毒干擾載體pLVshCXCR4-EGFP(2A)-Puro轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，可以下調(diào)細(xì)胞株中CXCR4的表達(dá)，并能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的凋亡，并能有效地降低卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力。

[關(guān)鍵詞]卵巢腫瘤； 趨化因子受體4； RNA干擾； 細(xì)胞凋亡； 侵襲能力[中圖分類號(hào)] R711.75； R737.33

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)06-0653-07

卵巢癌是婦科發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，居?jì)D科腫瘤病死率的首位，一直威脅著婦女的生命健康[1]。由于卵巢位居盆腔深部使得卵巢癌初期癥狀不明顯，且缺乏早期診斷依據(jù)，易造成浸潤轉(zhuǎn)移，這也是卵巢癌病死率較高的首要原因。 趨化因子(Chemokine)是一類具備趨化活性的細(xì)胞因子，能被腫瘤細(xì)胞所分泌，增進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[2-5]。趨化因子12(chemokine ligand 12，CXCL12)，也稱基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(stromal cell derived factor-1，SDF-1)與趨化因子受體4(chemokine CXC motif receptor 4，CXCR4)構(gòu)成CXCR4/SDF-1生物軸，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。有研究證實(shí)，CXCR4在卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)[6]，并且在卵巢癌的浸潤中有著重要的作用。RNA干擾(RNA interference ，RNAi)是目前分子生物領(lǐng)域興起的一項(xiàng)干擾技術(shù)，能夠特異的降解相應(yīng)基因的mRNA，使細(xì)胞的目的基因缺失或使其表達(dá)量下調(diào)[7]；Bcl-2(B-cell-leukemia/Lymphoma-2)與Bax(Bcl-2 Associated X Protein)基因是目前已知的在凋亡過程中功能相互對(duì)立的一組調(diào)控基因[8-9]，而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)是凋亡過程中最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，因此，3者的關(guān)系已成為進(jìn)來研究細(xì)胞凋亡的熱點(diǎn)。本研究期望能夠通過RNAi技術(shù)下調(diào)CXCR4的表達(dá)，探討短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)干擾CXCR4的表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3侵襲能力以及細(xì)胞凋亡的影響，以期為卵巢癌的治療找到一個(gè)新的靶點(diǎn)。

1材料和方法

1.1細(xì)胞株與慢病毒載體

人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3購于北京北納生物科技有限公司；慢病毒載體pLVshRNA-EGFP(2A)Puro，含U6啟動(dòng)子及綠色熒光蛋白基因，購自北京英盛茂業(yè)生物有限公司。

1.2主要試劑

RPMI-1640 購自Gibco公司，胰酶購自Hyclone公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，PBS、青霉素/鏈霉素購自北京鼎盛茂業(yè)生物有限公司，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 DNA Ligase、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、蛋白裂解液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、一步法WB(HRP)快速二抗試劑盒(鼠)購自北京康為世紀(jì)生物有限公司，Polyfect-v轉(zhuǎn)染試劑購自北京英盛茂業(yè)生物有限公司，去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒購自美國OMEGA公司，封閉蛋白干粉購自博士德公司，TRIZOL 試劑購自Invitrogen公司，SYBR Green qPCR Mix購自TOYOBO公司，Bax鼠抗人多克隆抗體、Bcl-2鼠抗人多克隆抗體、Bcl-xl鼠抗人多克隆抗體、cleaved caspase-3兔抗人多克隆抗體購于美國cell signaling Technology公司，含有基質(zhì)膠的Transwell小室購自美國Corning公司，引物合成及基因測(cè)序由北京鼎盛茂業(yè)生物有限公司完成。

1.3實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為3組：CON組(空白組)轉(zhuǎn)染pLV shRNA-EGFP(2A)Puro的卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，NC組(陰性組)轉(zhuǎn)染無義序列的pLVshCXCR4-EGFP(2A)Puro的卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和shCXCR4組 (實(shí)驗(yàn)組)轉(zhuǎn)染pLVshCXCR4-EGFP(2A)Puro卵巢癌細(xì)胞株SKOV3。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1CXCR4特異性干擾序列Genebank檢測(cè)CXCR4(序列號(hào)NM_003467)基因序列，The RNAi Consortium網(wǎng)站設(shè)計(jì)干擾序列4條(其中1條為陰性序列，3條為特異性干擾序列，)經(jīng)美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列檢索，檢測(cè)基因序列無同源性后交由北京鼎盛茂業(yè)生物有限公司合成(表1)。

1.4.2構(gòu)建pLVshCXCR4-EGFP(2A)Puro載體、病毒的包裝及滴度測(cè)定將合成的CXCR4干擾序列互補(bǔ)雙鏈退火，慢病毒載體pLVshRNA-EGFP(2A)Puro進(jìn)行BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切，將退火的雙鏈連入酶切的載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，挑取克隆送測(cè)序。測(cè)序無誤后進(jìn)行病毒包裝及滴度的測(cè)定。

1.4.3細(xì)胞培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3于RPMI-1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長，2～3 d換液傳代，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.4CXCR4 mRNA表達(dá)取對(duì)數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞，細(xì)胞密度為1×1010/L進(jìn)行轉(zhuǎn)染。病毒滴度為1×109TU/L，按MOI=病毒滴度×需加入的體積/細(xì)胞濃度，在3組細(xì)胞中分別加入50 μL病毒液，常規(guī)培養(yǎng)6 h后再次加入培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染前先計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，轉(zhuǎn)染24 h后，利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)GFP表達(dá)，GFP陽性細(xì)胞表達(dá)綠色熒光，計(jì)數(shù)GFP陽性細(xì)胞，選取轉(zhuǎn)染效率高的一組CXCR4陽性序列進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染24 h后以TRIZOL法提取總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。待測(cè)基因引物序列CXCR4 F為GGTCTATGTTGGCGTCTGGAT，R為TGAGGATGACTGTGGTCTTGAG β-actin F為CATTGCCGACAGGATGCAG，R為CTCGTCATACTCCTGCTTGCTG。1.4.5CXCR4、Bax、BCL-xl、Bcl-2及cleaved caspase-3蛋白表達(dá)將轉(zhuǎn)染后的3組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，BCA試劑盒對(duì)細(xì)胞裂解進(jìn)行蛋白定量，并測(cè)定總蛋白濃度，以30 μL/泳道上樣，按常規(guī)方法進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

1.4.6SiRNA對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的影響消化收集各組細(xì)胞，細(xì)胞濃度約為1×107個(gè)/L，用PBS重懸細(xì)胞，吹打均勻后加入AnnexinV溶液混勻，室溫避光孵育10～15 min，離心，PBS洗滌細(xì)胞，重懸細(xì)胞，加入PE染色細(xì)胞，4 ℃下避光孵育20 min，流式細(xì)胞儀分析凋亡率。

1.4.7Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，在上室加入300 μL預(yù)溫的無血清培養(yǎng)基，室溫下靜置15～30 min，使基質(zhì)膠再水化，20 min后吸去培養(yǎng)液。病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后常規(guī)培養(yǎng)24 h，撤去培養(yǎng)基中的血清使細(xì)胞饑餓12 h，調(diào)整細(xì)胞密度至 1×108個(gè)/L，不超過5×108個(gè)/L，上室加入細(xì)胞懸液，下室加入含有趨化因子及血清的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗濾膜表面，固定細(xì)胞，倒置Transwell小室，自然風(fēng)干后細(xì)胞染色計(jì)數(shù)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1pLVshCXCR4-EGFP(2A)puro載體測(cè)序

將插入干擾序列的載體送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的靶序列完全相符(圖1)，表明靶向沉默基因shCXCR4表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2pLVshCXCR4-EGFP(2A)puro轉(zhuǎn)染SKOV3

載體pLVshCXCR4-EGFP(2A)puro攜帶綠色熒光表達(dá)基因，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光表達(dá)。選取轉(zhuǎn)染效率較高的shCXCR4-3組(圖2)及NC組進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3特異性CXCR4shRNA對(duì)SKOV3細(xì)胞CXCR4mRNA表達(dá)的抑制作用

RT-qPCR和2-ΔΔCT法分析SKOV3中CXCR4的mRNA相對(duì)表達(dá)量，shCXCR4組較NC組的mRNA的表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02)；NC組與CON組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

圖1　構(gòu)建的shCXCR4 表達(dá)載體測(cè)序結(jié)果Fig.1　Expression medium sequencing of constructed shCXCR4

注：A為轉(zhuǎn)染前倒置顯微鏡下SKOV3細(xì)胞，B為轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡下SKOV3細(xì)胞圖2　慢病毒干擾載體轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞 (10×)Fig.2　Transfection of SKOV3cells with lentivirus vector

(1)與NC組相比，P<0.05圖3　CXCR4 shRNA對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞CXCR4 mRNA 表達(dá)的影響Fig.3　Influence of CXCR4 shRNA on expression of ovarian cancer SKOV3 cell CXCR4 mRNA

2.4特異性CXCR4shRNA對(duì)SKOV3細(xì)胞CXCR4、Bax、Bcl-xl、Bcl-2及cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響

與NC組比較，shCXCR4組CXCR4蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CON組與NC組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4；與NC組比較，Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)升高，而Bcl-2、Bcl-xl蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

2.5下調(diào)CXCR4對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的影響

通過AnnexinV和PE雙重標(biāo)記后上流式檢測(cè)結(jié)果顯示，shCXCR4組轉(zhuǎn)染后凋亡率(13.53±2.69)%較CON組(4.97±1.71)%和NC組(4.63±1.10)%明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而CON組及NC組的細(xì)胞凋亡率分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖6。

2.6干擾CXCR4表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell小室檢測(cè)干擾CXCR4表達(dá)后,細(xì)胞的穿膜數(shù)，shCXCR4組每視野為(22.184±2.185)，抑制率為58.94%，抑制率明顯高出NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；NC組(57.133±3.214)抑制率為-5.78%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，shCXCR4組SKOV3細(xì)胞的穿膜數(shù)較NC組明顯降低(P<0.05)，見圖7。

(1) 與NC組比較，P<0.05圖4　CXCR4 shRNA對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞CXCR4蛋白表達(dá)的影響Fig.4　Influence of CXCR4 shRNA on protein expression of ovarian cancer SKOV3 cell CXCR4 mRNA

(1)與NC組比較，P<0.05圖5　Bax與Bcl-2、Bcl-xl及cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)水平Fig.5　Downregulated CXCR4, expression of SKOV3 cell strains Bax與Bcl-2, Bcl-xl and cleaved caspase-3

圖6　SKOV3細(xì)胞凋亡率(AnnexinV和PE雙標(biāo)流式細(xì)胞儀)Fig.6　Apoptosis rate of SKOV3

圖7　干擾CXCR4表達(dá)后SKOV3細(xì)胞的穿膜數(shù)(Transwell小室)Fig.7　Transwell of interfered expression of CXCR4

3討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)腫瘤，發(fā)病率較高，占女性惡性腫瘤的五分之一，因其易發(fā)生浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，致死率位居?jì)D科腫瘤的首位，5年存活率低于50%[10]。趨化因子能夠增加內(nèi)皮細(xì)胞的聚集，下調(diào)免疫監(jiān)視，調(diào)整腫瘤細(xì)胞的外形從而使腫瘤細(xì)胞躲避免疫監(jiān)視，增進(jìn)自身的發(fā)展，以此獲取遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力[11]；CXCR4能產(chǎn)生趨化性，并伴隨著細(xì)胞重排、肌動(dòng)蛋白聚合、極化、形成偽足和黏附作用，影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[12]，CXCR4在多種惡性腫瘤中被檢測(cè)出，且存在高表達(dá)，被證實(shí)與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，正常卵巢組織及卵巢良性腫瘤中較少或無CXCR4表達(dá)，而在卵巢上皮性囊腺癌及其轉(zhuǎn)移灶中存在CXCR4的高表達(dá)，且在卵巢癌轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)趨勢(shì)明顯高于原發(fā)灶[14]；并且與卵巢癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移存在正相關(guān)[15-16]。本研究采用卵巢癌細(xì)胞株SKOV3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了在卵巢癌細(xì)胞株SKOV3上存在CXCR4的高表達(dá)，并且該表達(dá)能夠被特異性干擾片段下調(diào)。這與蔣玉萍等[17]采用CXCR4阻斷劑在體外能夠阻斷其表達(dá)相一致，這表明，在卵巢癌細(xì)胞上高表達(dá)的CXCR4能夠被特異性SiRNA及CXCR4拮抗劑下調(diào)。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主的有序性死亡，細(xì)胞凋亡與胚胎發(fā)育、自身免疫耐受、腫瘤發(fā)生、病毒感染等生理、病理過程密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡可通過流式細(xì)胞儀、DNA凝膠電泳等多種方法檢測(cè)。在細(xì)胞凋亡過程中，Bcl家族成員起著至關(guān)重要的作用。其分為2大類，一類是抗凋亡的主要有Bcl-2，Bcl-xl，另一類是促細(xì)胞死亡的，主要包括Bax，Bcl-XS等，Bcl-2與Bax是目前研究較深入的凋亡調(diào)控基因，Bcl-2是凋亡抑制基因，其活性增高，可抑制細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞生命[18]。Bax是一種促凋亡基因，抑制細(xì)胞增值，因此通過這兩種基因表達(dá)的檢測(cè)，能反映出細(xì)胞的凋亡[19]。本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，在下調(diào)CXCR4的表達(dá)后，shCXCR4組的細(xì)胞凋亡率(13.53±2.69)%明顯高于NC組(4.63±1.10)%及CON組(4.97±1.71)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在WB檢測(cè)Bax、Bcl-xl、Bcl-2及cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)的結(jié)果中得出，在shCXCR4組抗凋亡基因Bcl-2及Bcl-xl的蛋白表達(dá)較CON組及NC組明顯減少，而Bax在shCXCR4的表達(dá)則反之；凋亡是一個(gè)發(fā)生在由caspase家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程，即caspase在凋亡信號(hào)的作用下，啟動(dòng)型caspase先通過結(jié)合特異輔因子而激活，發(fā)揮水解蛋白的作用，從而激活下游效應(yīng)型caspase，一旦效應(yīng)caspase被激活，便大范圍的水解細(xì)胞內(nèi)靶物質(zhì)，從而降解細(xì)胞內(nèi)蛋白，最終使細(xì)胞不可逆走向死亡[20]，而caspase-3就位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，執(zhí)行剪切細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白的作用，直接使細(xì)胞發(fā)生死亡；在本實(shí)驗(yàn)中，下調(diào)CXCR4后，cleavedcaspase-3被激活，降解腫瘤細(xì)胞內(nèi)蛋白，促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Katkoori[21]的研究顯示，在實(shí)驗(yàn)中利用CXCR4的拮抗劑下調(diào)CXCR4后，能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞及直腸癌細(xì)胞的凋亡，并能有效地降低其增殖與遷移能力；在Hamdan[22]對(duì)尤文氏肉瘤的研究中，利用AMD3100拮抗CXCR4的表達(dá)能夠引起骨髓細(xì)胞的凋亡的同時(shí)能夠減少腫瘤血管的灌注；我們的結(jié)果與其他的研究結(jié)果相同，下調(diào)CXCR4可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。

CXCR4在卵巢癌中的作用還與其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力有關(guān)[23]。細(xì)胞外基質(zhì)是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要屏障，其主要由基底膜和細(xì)胞間質(zhì)組成。CXCR4可以誘導(dǎo)動(dòng)員細(xì)胞內(nèi)鈣離子，活化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK-1/2)，使MMP-9分泌增加，IV型膠原酶纖維被降解，破壞基底膜并誘導(dǎo)新生血管的形成，腫瘤局部的微環(huán)境被重新建立，使腫瘤細(xì)胞更易獲得轉(zhuǎn)移性[24]。本研究在實(shí)驗(yàn)中下調(diào)了卵巢癌細(xì)胞上CXCR4的表達(dá)，在此基礎(chǔ)上又進(jìn)行了侵襲能力的檢驗(yàn)，shCXCR4組細(xì)胞穿膜數(shù) (22.184±2.185)，與CON組 (54.018±2.368)及NC組( 57.133±3.214)相比明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；由此可得出，腫瘤細(xì)胞上CXCR4的表達(dá)降低后其侵襲能力較未干擾前有了明顯降低，這與之前關(guān)于下調(diào)CXCR4降低腫瘤細(xì)胞侵襲能力的研究結(jié)論相符。

卵巢癌是婦科高發(fā)的惡性腫瘤之一，治療后易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)是臨床治療的一個(gè)難點(diǎn)。本研究表明，利用特異性shRNA能夠?qū)XCR4進(jìn)行有效干擾，這或許能成為卵巢癌治療的一個(gè)新的理論依據(jù)。

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(2016-03-05收稿，2016-05-21修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 趙毅

Influence of Lentivirus-Mediated shRNA-CXCR4 on Ovarian Cancer Cell Apoptosis and Invasion

LAI Jing1, ZI Dan2, YANG Yingjie3

(1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.GuizhouTumorHospital,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To evaluate the influence of CXCR4-targeted short hairpin RNA on invasion ability and apoptosis of ovarian cancer line SKOV3. Methods: CXCR4-shRNA lentivirus with Green fluorescent protein was transfected into ovarian cancer cell line SKOV3. RT-qPCR and western blot were employed to measure the expression of CXCR4 RNA and protein expression of CXCR4, Bax, Bcl-2, Bcl-xl and Caspase-3. Apoptosis rate of SKOV3 cell was detected through Annexin V/PE double staining flow cytometry. Transwell chamber was employed to estimate the invasiveness for SKOV3. Results: Transfected pLVshCXCR4-EGFP (2A)-Puro. 2.CXCR4 RNA expression level and protein in ShCXCR4 group was (0.40±0.13) and (0.45±0.23) ，respectively lower than that in NC group (1.109±0.21, P<0.05). Interference of CXCR4 expression in cells can increase Bax and Cleaved caspase-3 protein expression in SKOV3 cells, reduced the Bcl-xl and the Bcl-2 protein expression. Flow cytometry instrument was adopted to detect cell apoptosis rate, shCXCR4 group was significantly higher than that of NC group and CON group, difference was statistically significant(P<0.05); in invasion test ,cell number of ShCXCR4 group was obviously lower than that in NC group and CON group, inhibition rate of shCXCR4 group was 58.94%, difference was statistically significant(P<0.01). Conclusion: CXCR4 RNA interference mediated with pLVshCXCR4-EGFP (2A)-Puro could effectively downregulate the expression of CXCR4 RNA, and promote the cancer cell apoptosis as well as decrease the invasion ability of cancer cells.

[Key words]ovarian cancer; chemokine receptor 4; RNA interfence; apoptosis; invasion

*[基金項(xiàng)目]貴州省科技廳聯(lián)合基[黔科合LG(2011)032號(hào)]

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.008

**通信作者 E-mail:2816497455@qq.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-06-16網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160616.1715.044.html