HnRNPA2/B1shRNA慢病毒載體感染Hela細胞的穩定株篩選*

劉　瑤， 石　祥， 方　文*

(貴州醫科大學 臨床生化教研室， 貴州 貴陽　550004)

·專題研究·

HnRNPA2/B1shRNA慢病毒載體感染Hela細胞的穩定株篩選*

劉瑤**， 石祥， 方文***

(貴州醫科大學 臨床生化教研室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 篩選不均一核糖核蛋白A2/B1(hnRNPA2/B1)的短發夾RNA (shRNA)慢病毒載體感染宮頸癌細胞株Hela細胞的穩定細胞株。方法: 利用hnRNPA2/B1 shRNA 慢病毒載體轉染Hela細胞，采用嘌呤霉素抗性方法篩選穩定轉染的Hela細胞系；將Hela細胞分為空白組(Hela)、陰性組(NC-shRNA)、干擾組1(shRNA1)、干擾組2(shRNA2)、干擾組3(shRNA3)和干擾組4(shRNA4)，實時熒光定量 PCR(RT-PCR)檢測各組細胞hnRNPA2/B1 mRNA表達水平，Western blot檢測hnRNPA2/B1蛋白表達水平，篩選干擾沉默效率最高的細胞作為穩定沉默hnRNPA2/B1基因的穩轉株。結果: 經篩選獲得穩定轉染的宮頸癌Hela細胞株，干擾組2，干擾組3和干擾組4與空白組比較，hnRNPA2/B1基因和蛋白表達量降低，差異有統計學意義(P<0.05)，其中干擾組4沉默效率最高。結論: 成功構建hnRNPA2/B1 shRNA 慢病毒載體感染的Hela穩定細胞株。

[關鍵詞]RNA干擾； 短發夾RNA； 宮頸癌； Hela細胞； 慢病毒；不均一核糖核蛋白基因

在全球女性惡性腫瘤中，宮頸癌的發病率僅次于乳腺癌，嚴重威脅著女性的健康[1]。化療在惡性腫瘤治療中占據著不可替代的地位，但其對大多數惡性腫瘤的療效不佳。本課題組前期用洛鉑作用宮頸癌細胞，用雙向電泳及質譜技術分析鑒定差異表達蛋白，發現不均一核糖核蛋白A2/B1(heterogeneous nuclear ribonucleoproteinA2/B1, hnRNPA2/B1)表達下調[2]。HnRNPA2/B1 是一組參與基因轉錄與翻譯的前體mRNA結合蛋白，它的異常表達可使基因表達過程失去正常調控，導致正常細胞發生癌變[3]。有實驗表明干擾hnRNPA2/B1會增加抗癌藥物對胰腺癌細胞的敏感性[4]。本課題組前期成功構建了hnRNPA2/B1短發夾RNA (short hairpin RNA, shRNA)的重組慢病毒質粒，本研究把前期構建好的重組慢病毒穩定轉染宮頸癌Hela細胞，通過RT-PCR和Western blot篩選出沉默效率最高的穩轉Hela細胞株，為深入研究hnRNPA2/B1 在宮頸癌發生及治療奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料和試劑

hnRNPA2/B1-shRNA(1-4)慢病毒液、慢病毒陰性對照(negative control-shRNA，NC-shRNA)為本實驗組前期制備，Hela細胞(中國科學院細胞庫)，DMEM培養基(Hyclone公司，美國)，胎牛血清(杭州四季青公司)，SYBR Green PCR Master Mix(ABI公司，美國)，BSA(Sigma公司，美國)，一抗(hnRNPA2/B1)(biowoeld公司，美國)，二抗(鼠抗人)(Jackson ImmunoResearch公司，美國)，顯影定影試劑盒、超敏ECL化學發光試劑盒(碧云天生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養Hela細胞置于完全培養基(含10%的胎牛血清、88% DMEM，另添加1%抗生素和1% L-谷氨酰胺)37 ℃、5% CO2混合氣體培養箱中培養。每2～3 d更換1次培養液，換液時用PBS洗滌。

1.2.2慢病毒感染Hela細胞及實驗分組用胰酶消化處于對數生長期的Hela細胞，制成細胞懸液，接種到3.5 cm培養皿中。待細胞貼壁達到50%的融合度時，將前期制備好的病毒原液融化后，用含5 mg/L Polybrene新鮮培養基按預實驗MOI值=10×稀釋病毒原液，將含有NC-shRNA稀釋液加到陰性對照組細胞中，含有hnRNPA2/B1-shRNA慢病毒稀釋液加到處理組細胞中。在感染24 h后將含有慢病毒的培養液換成正常培養液，細胞繼續培養72 h后，加入終濃度為2 mg/L的Puromycin(嘌呤霉素)進行篩選，藥物篩選約10 d后，拍熒光照片。由于慢病毒載體為pGMLV-SC5RNAi慢病毒載體，含有eGFP基因和抗Puromycin基因，因此轉染慢病毒的細胞在具有抗Puromycin作用的同時會發出綠色熒光。實驗分為6組：空白組(Hela細胞)、陰性組(轉染NC-shRNA的Hela細胞)、干擾組1(轉染shRNA1的Hela細胞)、干擾組2(轉染shRNA2的Hela細胞)、干擾組3(轉染shRNA3的Hela細胞)和干擾組4(轉染shRNA4的Hela細胞)。

1.2.3hnRNPA2/B1 mRNA檢測慢病毒感染細胞成功后，將培養皿中10 cm2細胞加入1 mL Trizol液，分別提取每組細胞的總RNA。按下列體系和步驟進行逆轉錄，RNA 2 μL， 5×VILO Reaction Mix 4 μL， 10×SuperScript Enzyme Mix 2 μL， DEPC-treated water 12 μL，輕輕混勻后，25 ℃孵育10 min，42 ℃孵育60 min，85 ℃孵育5 min終止反應，所得到的cDNA -20 ℃保存備用。取Hela細胞的cDNA為模板進行RT-PCR，向體系中加入超純水5.7 μL，2×SYBR Mix7.5 μL，分別加入上游引物和下游引物各0.15 μ(表1)，模板cDNA 1.5 μL。反應條件為預變性95 ℃ 10 min，PCR循環95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環，溶解曲線60～95 ℃。通過RT-PCR檢測細胞樣品中目的基因和內參基因的表達量，根據qPCR反應曲線得到各樣品目的基因和內參基因的域值循環數Ct值(threshold cycle number,，Ct值)，采用ΔΔCt的方法進行相對定量。數據分析使用QIAGEN公司RT2 Profiler PCR Array Data Analysis 系統。使用轉染陰性干擾載體的樣品作為對照樣品，比較各干擾載體組樣品目的基因的表達，并計算干擾效果。ΔΔct=(待測樣品的目的基因的ct平均值—待測樣本的內參基因的

表1　目的基因和內參基因引物序列

ct的平均值)-(對照樣品的目的基因的ct的平均值-對照樣本的內參基因的ct的平均值)基因的表達量F=2-ΔΔct，目標基因的沉默效率為1-2-ΔΔct。

1.2.4hnRNPA2/B1蛋白檢測 慢病毒感染細胞后，取出狀態良好感染成功的靶細胞，PBS洗滌2次，加入適量預冷的1×Lysis Buffer，取上清，用Bradford方法測蛋白濃度。每個樣品取相同總蛋白量，加入1/3體積的4× loading buffer上樣緩沖液，混勻后，沸水浴煮10 min，4 ℃存放備用。制膠，上樣，電泳可以用protein molecular weight maker作參照，轉膜，封閉，封閉結束后，用TBST溶液洗膜2次，10 min/次。用一抗(用含5% BSA的TBST溶液稀釋一抗原液)4 ℃孵育過夜，用TBST溶液洗膜3次，10 min/次，用二抗(用含5%脫脂牛奶的TBST溶液稀釋相應的二抗)室溫孵育2 h。采用ECL試劑盒進行顯色，取出X光片，晾干，分析。

1.3統計學處理

2結果

2.1慢病毒感染Hela細胞

藥物篩選10 d后，熒光顯微鏡下，無細胞死亡，細胞內有綠色熒光表達(圖1)，說明轉染hnRNPA2/B1 shRNA 慢病毒載體的Hela細胞株篩選成功。

注:A為shRNA1、B為shRNA2、C為shRNA3、D為shRNA4，E為NC-shRNA圖1　藥物篩選后的Hela細胞(100×)Fig.1　Hela cells under fluorescence microscope after drug screening

2.2慢病毒感染Hela細胞后hnRNPA2/B1 mRNA表達及抑制率

Hela細胞中的目的基因和內參基因擴增曲線及熔解曲線(圖2)，說明hnRNPA2/B1和Actin為特異性擴增，無非特異性產物產生，實驗結果可靠。陰性組與空白組hnRNPA2/B1基因表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)；干擾組2，干擾組3和干擾組4與空白組比較，hnRNPA2/B1基因表達量降低(P<0.05)，其中干擾組4沉默效率最高(76.58%)。見表2。

2.3慢病毒感染Hela細胞后hnRNPA2/B1 蛋白表達及抑制率

陰性組與空白組hnRNPA2/B1蛋白表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)；干擾組1、干擾組2，干擾組3和干擾組4與空白組比較，hnRNPA2B1蛋白表達量降低，差異有統計學意義(P<0.05)，其中干擾組4的沉默效率最高(76.24%)。見圖3。

3討論

宮頸癌嚴重威脅著女性的健康。2015中國癌癥統計數據指出，近年女性發病率持續上升的六種癌癥中就包括宮頸癌，女性死亡率持續上升的三種癌癥中也包括宮頸癌。治療宮頸癌最有效的化療藥物是鉑類藥物，但自從鉑類藥物開始應用于臨床以來療效不佳。這就需要尋找新的治療靶點。

圖2　HnRNPA2/B1和Actin擴增曲線及融解曲線Fig.2　Amplification curve and Melting curve of HnRNPA2/B1 and Actin

組別ACTINCtHNRNPA2B1Ct2-ΔΔCt抑制率(%)空白組17.21±0.0612.44±0.251.00±0.130陰性組17.14±0.0912.57±0.190.95±0.084.25干擾組117.41±0.0412.82±0.120.90±0.229.74干擾組217.17±0.0913.19±0.04(1)0.51±0.02(2)48.44干擾組317.19±0.0913.79±0.08(1)0.38±0.01(2)61.39干擾組417.37±0.0814.71±0.04(1)0.23±0.03(2)76.58

與空白組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01

注：A為條帶圖，1組～4組為干擾組；B為柱狀圖，(1)與空白組比，P<0.01圖3　各組hnRNPA2/B1-shRNA的沉默效果(Western Blot) Fig.3　Western Blot verifies the silence effect of hnRNPA2/B1-shRNA

核內不均一核糖核蛋白A2/B1是由hnRNPA2和hnRNPB1共同組成的RNA連接蛋白復合體[5]。hnRNPA2與hnRNPB1是起源于人的第7染色體的p15上的同一個單拷貝基因，經過不同的剪接作用形成的變異體，兩者不同之處在于hnRNPB1的第2個外顯子在選擇性剪切的作用下N端額外插入了12個氨基酸序列[6]。HnRNPA2/B1在胞質與核內之間穿梭具有將mRNA輸出到胞質的功能，參與mRNA的轉運、RNA轉錄、轉錄后調節、RNA的代謝、DNA的復制、外顯子剪切位點選擇、Pre-mRNA的成熟和降解，對細胞凋亡的調節、細胞的有絲分裂等也起重要作用[7]。近年來研究表明，hnRNPA2/B1與多種腫瘤的發生、發展密切相關。hnRNPA2/B1已經被證實是一種原癌基因，不僅參與腫瘤形成和癌細胞的惡性增殖，同時也已成為腫瘤診斷和預后判定的指標[8]。HnRNPA2/B1在惡性腫瘤的發生、發展過程中調控腫瘤細胞的代謝、分化、遷移、侵襲、多藥耐藥和血管形成等，其中對細胞增殖與凋亡作用的調控更為顯著[9-10]。細胞過度增殖和細胞凋亡失調是近年來腫瘤研究熱點之一，陳倩竹[11]指出通過下調骨肉瘤MG-63細胞中hnRNPA2/B1基因的表達，發現細胞增殖和成瘤能力均明顯減弱，同時早期凋亡增加。Chen等[12]研究發現在胰腺癌細胞中hnRNPA2B1可與Bcl-X mRNA結合, 抑制hnRNPA2B1基因可上調Bcl-X(S)與Bcl-X(L)的比值，從而促進胰腺癌細胞的凋亡。有研究指出，上調hnRNPA2/B1基因的表達水平，細胞增殖活性會隨著增強及促進腫瘤形成[13]。同時，在裸鼠成瘤方面，抑制鼠惡性膠質瘤細胞 hnRNPA2/B1可抑制腫瘤的形成，試驗證明hnRNPA2/B1基因序列可被抑制，減少hnRNPA2/B1過度表達，從而抑制腫瘤形成[14]。可能的機制是由于hnRNPA2/B1與端粒單鏈 DNA 重復序列特異性結合后，能保護后者免受核酶分解。同時，hnRNPA2/B1還能激活端粒酶，促進端粒延伸，導致腫瘤細胞無限增殖[7]，但具體機制還不是很清楚。因此，對hnRNPA2/B1基因的深入研究有助于尋找治療宮頸癌的新靶點。

本課題組前期成功構建了hnRNPA2/B1慢病毒干擾載體。本研究應用慢病毒轉染宮頸癌Hela細胞，由于pGMLV-SC5RNAi慢病毒載體本身攜帶eGFP基因和抗puromycin基因，因此，觀察到細胞發出綠色熒光，同時用終濃度為2 mg/L的puromycin進行篩選，最終獲得穩定轉染慢病毒的細胞株。與空白對照組和陰性對照組比較，用RT-PCR和Western blot對4組Hela細胞進行hnRNPA2/B1表達檢測，發現陰性對照組與空白組表達差異不顯著，而shRNA4干擾組沉默效率在mRNA水平和蛋白水平均達到70%以上，說明本研究構建的慢病毒干擾載體hnRNPA2B1-shRNA4可以沉默hnRNPA2B1基因的表達，篩選出shRNA4組Hela細胞為穩定沉默hnRNPA2/B1基因表達的細胞株。為進一步探討hnRNPA2/B1基因在宮頸癌Hela細胞中的作用機制打下基礎。

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(2016-03-20收稿，2016-05-27修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 劉華

Screening of Stable Hela Cell Infected with hnRNPA2/B1 shRNA Lentivirus

LIU Yao, SHI Xiang, FANG Wen

(DepartmentofClinicalBiochemistry,GuizhouMedcialUniversity，Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To screen the stable Hela cell line infected with hnRNPA2/B1shRNA lentivirus vector. Methods: hnRNPA2/B1 shRNA lentivirus vector was used to stably transfect into HeLa cells. The Hela cell lines were screened by using the method of resistance of puromycin. Hela cell lines were divided into blank group(Hela group), negative group (NC-shRNA group), interference group1 (shRNA1group), interference group2 (shRNA2 group), interference group3 (shRNA3 group) and interference group4 (shRNA4 group). RT-PCR was adopted to detect the mRNA expression level of hnRNPA2/B1 and Western blot adopted to detect the protein expression level of hnRNPA2/B1. A group of cells with the highest silencing efficiency was selected as the Hela lines of hnRNPA2/B1 gene stable silencing. Results: Stably transfected HeLa cell line of cervical cancer was obtained by screening. Compared with blank group, mRNA level and protein level of hnRNPA2/B1 gene expression significantly decreased in shRNA2 group, shRNA3 group and shRNA4 group (P<0.01). Among them, silence efficiency was highest in shRNA4 group. Conclusion: Stable Hela cell line infected with hnRNPA2/B1shRNA lentivirus vector is successfully constructed.

[Key words]RNA interference; Short hairpin RNA; cervical carcinoma; Hela cell line; lentivirus; heterogeneous nuclear ribosomal protein gene

*[基金項目]國家自然科學基金(81560481)

[中圖分類號]Q782

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)06-0625-05

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.002

**貴州醫科大學2013級碩士研究生

***通信作者 E-mail:281123997@qq.com

網絡出版時間：2016-06-16網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160616.1645.020.html