甲氨蝶呤與雷公藤多苷片聯用對類風濕性關節炎大鼠的治療作用

鐵寧　張桂芝（內蒙古醫科大學附屬醫院，內蒙古　呼和浩特010059）

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甲氨蝶呤與雷公藤多苷片聯用對類風濕性關節炎大鼠的治療作用

鐵寧張桂芝
（內蒙古醫科大學附屬醫院，內蒙古呼和浩特010059）

【摘要】目的觀察甲氨蝶呤與雷公藤多苷片聯用對大鼠類風濕性關節炎（RA）的治療作用。方法50只大鼠隨機選取10只為正常組，其余40只建立Ⅱ型膠原誘導的關節炎（CIA）大鼠模型，然后分為模型組、甲氨蝶呤組、雷公藤組和聯合治療組，每組10只。采用甲氨蝶呤與雷公藤多苷片進行治療，用藥后每隔3 d評估其關節炎指數和腫脹度，治療7周后，采用ELISA法檢測關節液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6 （IL-6）水平，并通過實時熒光定量PCR法檢測大鼠滑膜組織中血管內皮因子（VEGF）、轉化生長因子（TGF-β1）mRNA的表達。結果與模型組相比，在用藥第24日、36日和48日各治療組大鼠關節炎指數評分和腫脹度顯著降低（P＜0.05），并且聯合治療組大鼠在用藥第24日、36日和48日的關節炎指數評分和腫脹度顯著低于甲氨蝶呤組和雷公藤組（P＜0.05）；與正常組相比，所有造模組大鼠關節液中TNF-α和IL-6水平均顯著提高（P＜0.05）；與模型組相比，各治療組大鼠關節液中TNF-α和IL-6水平均顯著降低（P＜0.05），并且聯合治療組大鼠關節液中IL-6的水平降低程度顯著高于甲氨蝶呤組和雷公藤組（P＜0.05）；與正常組相比，所有造模組大鼠關節滑膜組織中VEGF、TGF-β1 mRNA表達均顯著提高（P＜0.05）；與模型組相比，各治療組VEGF、TGF-β1 mRNA表達均顯著降低（P＜0.05），并且聯合治療組大鼠關節滑膜組織中VEGF、TGF-β1 mRNA表達的降低程度顯著高于甲氨蝶呤組和雷公藤組（P＜0.05）。結論甲氨蝶呤聯合雷公藤多苷治療RA能最大限度地發揮藥物的協同作用，促進RA大鼠癥狀改善，其作用機制可能與降低關節液中TNF-α和IL-6水平和抑制關節滑膜組織中VEGF、TGF-β1 mRNA表達有關。

【關鍵詞】甲氨蝶呤雷公藤多苷類風濕性關節炎實時熒光定量PCR療效

類風濕性關節炎（RA）是一類由于自身免疫系統疾病引起滑膜慢性炎癥，出現關節病變，若不及時有效治療，極易形成侵襲性血管翳，最終導致患者關節功能喪失［1］。目前，甲氨喋呤為國內外公認RA治療的首選和基礎藥物，但療程較長，不少患者難以耐受［2］。雷公藤多苷為我國傳統中草藥雷公藤的主要活性成分，研究顯示其具有良好的抗炎、免疫調節、抗腫瘤和改善微循環活性的作用，對自身免疫性疾病RA的治療具有良好的前景［3］。基于此，筆者通過建立Ⅱ型膠原誘導的關節炎（CIA）大鼠模型，研究甲氨蝶呤聯合雷公藤治療對其關節液中炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）的濃度水平及對滑膜炎癥發展起關鍵作用的轉化生長因子（TGF-β1）mRNA和血管內皮因子（VEGF）mRNA表達的影響，探討二者聯合對治療RA作用效果。現報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物Wistar大鼠50只，雌性，10～12周齡，體質量（200±20）g。由內蒙古醫科大學實驗動物中心提供。動物許可證號：SCXK（蒙）2015-0001。大鼠籠中散養，正常光照，室溫（25±2）℃，正常食水飼養。

1.2試劑與儀器甲氨蝶呤片（通化茂祥制藥有限公司，國藥準字H22022674，規格為2.5 mg/片），雷公藤多苷片（浙江普洛康裕天然藥物有限公司，國藥準字Z33020778，規格為10 mg/片），RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒和Ultra SYBR Mixture購于北京全式金生物技術有限公司公司，牛Ⅱ型膠原（10 mg）和不完全弗氏佐劑（5 mL）均購于德國Sigma公司，大鼠IL-6和TNF-α ELISA試劑盒購于上海酶聯生物科技有限公司，Multiskan MK3酶標儀購于美國Thermo Fisher Scientific公司，ABI 7900HT型熒光定量PCR儀購于美國Applied Biosystems公司，Z216MK微量高速冷凍型離心機購于德國Hermle公司。

1.3造模與分組1）CIA大鼠模型建立［4］。在無菌條件下，利用均質儀將牛Ⅱ型膠原和弗氏不完全佐劑按1∶1比例充分乳化，牛Ⅱ型膠原的終濃度為1 mg/mL。初次免疫位于尾根部左側皮內，注射劑量為0.2 mL膠原乳劑。加強免疫在初次免疫1周后于尾根部右側皮內及左腳趾處，注射劑量為0.2 mL膠原乳劑。2）動物分組及給藥方式。50只大鼠中隨機選取10只作為正常組，其余大鼠建立CIA模型。造模成功后，大鼠隨機分為模型組、甲氨蝶呤組、雷公藤組和聯合治療組，每組10只。

1.4給藥方法自造模2周后，治療組開始灌胃給藥，每日1次，連續灌胃7周。其中，甲氨蝶呤組給藥劑量為1 mg/kg，雷公藤組的給藥劑量為3 mg/kg。模型組和正常組灌服等體積的0.9%氯化鈉注射液。

1.5檢測方法1）關節炎指數和腫脹度測定。給藥后，每隔3 d對每個大鼠進行關節炎評分，并計算關節腫脹度。其中，關節炎評分標準參照0～4級關節評分法［5］，即0分為腳爪正常，無紅腫癥狀；1分為趾關節出現輕度紅腫；2分為趾關節和足趾出現紅腫；3分為整個腳爪出現紅腫；4分為踝關節出現紅腫，并發生嚴重變形。關節腫脹體積采用趾體積測量儀進行測定，腫脹度（%）=（Vt-V0）/V0×100%，其中V0為造模前的容積，Vt為造模后的容積。2）關節液中TNF-α和IL-6測定。治療7周后，大鼠仰位固定，打開膝關節腔，用注射器取1 mL氯化鈉注射液注入關節腔中，然后收集關節腔液，并于4℃2000 rpm離心15 min，取上清液置于-80℃冰箱保存待測。參照大鼠ELISA試劑盒說明書測定TNF-α和IL-6含量。3）大鼠關節滑膜組織TGF-β1 mRNA和VEGF mRNA表達的檢測。打開膝關節腔后，用眼科直鑷鈍性分離關節囊的滑膜層和纖維層，完整剝離滑膜組織，于-80℃冰箱保存待測。參照試劑盒說明書分別提取大鼠滑膜組織的總RNA，并逆轉錄為cDNA，以β-actin為內對照進行實時熒光定量，反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火10 min，40個循環。根據Gene Bank提供Wistar大鼠TGF-β1、VEGF的mRNA序列設計目的基因的引物序列，見表1所示。根據各組的平均CT值，計算出每個目的基因相對表達量。

表1　目的基因的引物設計

1.6統計學處理應用SPSS16.0統計軟件分析。計量數據以（±s）表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠不同時間點關節炎指數、腫脹度評分見表2，表3。大鼠建立CIA模型后，出現足趾關節紅腫，局部伴潰瘍，并且精神倦怠甚至萎靡，運動遲緩。正常組大鼠無上述現象。與模型組相比，在用藥第24日、36日和48日各治療組大鼠關節炎指數評分和腫脹度顯著降低（P＜0.05），并且聯合治療組大鼠在用藥第24日、36日和48日的關節炎指數評分和腫脹度顯著低于甲氨蝶呤組和雷公藤組（P＜0.05）。

表2　各組大鼠不同時間點關節炎指數評分比較（分，±s）

表2　各組大鼠不同時間點關節炎指數評分比較（分，±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與聯合治療組比較，△P＜0.05。下同。

組別　n正常組　10模型組　10甲氨蝶呤組　10 12 d　24 d　36 d　48 d 0000 4.76±1.37 8.06±2.93　7.82±3.05　7.74±2.91 4.52±1.08 6.63±1.76*△6.14±2.17*△5.78±1.52*△雷公藤組　10　4.59±0.95 6.84±1.31*△6.26±1.38*△5.73±1.04*△聯合治療組　10　4.43±0.81 5.97±1.24*5.40±0.95*　4.85±0.87*

表3　各組大鼠不同時間點腫脹度比較（%，±s）

表3　各組大鼠不同時間點腫脹度比較（%，±s）

組別　n正常組　10模型組　10甲氨蝶呤組　10 12 d　24 d　36 d　48 d 0 0 0 0 83.51±0.33 93.24±0.36　92.78±0.31　83.51±0.33 82.37±0.23 88.16±0.25*△85.24±0.23*△79.26±0.19*△雷公藤組　10 82.42±0.18 89.58±0.23*△86.59±0.26*△80.42±0.18*△聯合治療組　10 82.15±0.13 85.69±0.18*79.20±0.11*74.51±0.12*

2.2各組大鼠關節液中TNF-α和IL-6水平比較

見表4。結果顯示，與正常組相比，所有造模組大鼠關節液中TNF-α和IL-6水平均顯著提高（P＜0.05）；與模型組相比，各治療組大鼠關節液中TNF-α和IL-6水平均顯著降低（P＜0.05），并且聯合治療組大鼠關節液中IL-6的水平降低程度顯著高于甲氨蝶呤組和雷公藤組（P＜0.05）。

表4　各組大鼠關節液中TNF-α和IL-6水平比較（pg/mL，±s）

表4　各組大鼠關節液中TNF-α和IL-6水平比較（pg/mL，±s）

與正常組比較，*P＜0.05；與聯合治療組比較，△P＜0.05。下同。

組別　n　TNF-α　IL-6正常組　10　19.27±1.94　20.98±2.11模型組　10　46.25±8.53*　67.39±12.79*甲氨蝶呤組　10　25.51±3.31*　32.46±5.65**△雷公藤組　10　24.38±2.95*　28.71±3.70**△聯合治療組　10　23.73±2.49*　24.81±2.83**△

2.3各組大鼠關節滑膜組織VEGF和TGF-β1表達的情況比較見表5。通過熒光定量PCR對凋亡基因VEGF、TGF-β1 mRNA表達進行定量分析。結果顯示，與正常組相比，所有造模組大鼠關節滑膜組織中VEGF、TGF-β1 mRNA表達均顯著提高（P＜0.05）；與模型組相比，各治療組VEGF、TGF-β1 mRNA表達均顯著降低（P＜0.05），并且聯合治療組大鼠關節滑膜組織中VEGF、TGF-β1 mRNA表達的降低程度顯著高于甲氨蝶呤組和雷公藤組（P＜0.05）。

表5　各組大鼠關節滑膜組織VEGF和TGF-β1表達情況比較（μmol/mL，±s）

表5　各組大鼠關節滑膜組織VEGF和TGF-β1表達情況比較（μmol/mL，±s）

組別　n　VEGF　TGF-β1正常組　10　0.288±0.079　0.257±0.054模型組　10　0.872±0.152*　0.752±0.177*甲氨蝶呤組　10　0.468±0.072**△　0.462±0.088**△雷公藤組　10　0.427±0.084**△　0.445±0.107**△聯合治療組　10　0.384±0.057**　0.402±0.065**

3　討論

雷公藤多苷作為雷公藤的主要活性成分，由于具有較強的祛風除濕、通絡解毒、免疫調節活性而倍受關注。如何偉珍等［6］觀察雷公藤多苷治療老年類風濕關節炎，結果發現其能迅速改善與類風濕關節炎相關的各項癥狀、體征和患者的生活質量，并有良好的安全性。又如宋明愛等［7］研究發現雷公藤多苷能抑制慢性腎小球腎炎患者血清中炎癥因子IL-6和TNF-α含量，促進患者康復。近年來，RA在我國的發病率逐年提高，并且治療后反復發作，致殘率較高，給患者身體健康和生活質量帶來了嚴重威脅。目前全世界對RA的治療尚無較好的根治方法。我國多數醫家認為采用中西醫結合治療能最大限度地發揮藥物的協同作用，提高療效，降低毒副作用［8-9］。本研究中，筆者在用藥第24日、36日和48日各治療組大鼠關節炎指數評分和腫脹度均顯著低于模型組，并且聯合治療組大鼠關節炎指數評分和腫脹度降低程度顯著高于甲氨蝶呤組和雷公藤組，提示甲氨蝶呤和雷公藤多苷均能有效緩解RA癥狀，當兩藥聯合作用有助于促進RA癥狀緩解。

既往研究表明，RA關節滑膜組織內聚集大量免疫細胞，并分泌一系列炎癥因子，其中TNF-α和IL-6能夠激活淋巴T細胞表面CD40受體與滑膜細胞結合，啟動胞內NK-κB核轉錄因子，進而促進細胞增殖和基質金屬蛋白酶分泌，加速關節軟骨的破壞。因此，TNF-α和IL-6在RA的發展過程中發揮重要作用［10-11］。本研究結果顯示與正常組相比，各治療組大鼠關節液中TNF-α和IL-6水平均顯著低于模型組，并且聯合治療組大鼠關節液中IL-6的水平降低程度顯著高于甲氨蝶呤組和雷公藤組，提示甲氨蝶呤和雷公藤多苷均能有效降低RA大鼠關節液中TNF-α和IL-6的水平，減輕細胞因子對滑膜細胞的刺激，緩解疾病的進一步惡化，并且當兩藥聯合作用時，IL-6水平降低程度更高，對于破壞炎癥因子聚集構成的惡性循環具有實際意義。

RA的發病過程涉及諸多基因的調控，比如VEGF、TGF-β1等，二者均是參與血管形成的重要因子。其中，VEGF不僅具有有絲分裂活性，通過高效地刺激血管內皮細胞增生、移動并改變其基因表達，促使血管形成，同時還能增大血管內皮細胞通透性，導致纖維蛋白滲出并凝結于血管外，構成血管形成的臨時基質［12］。因此，VEGF的高表達與RA滑膜血管翳的形成具有密切關系。TGF-β1是TGF-β家族的成員，研究發現其具有調節細胞生長和分化功能，其過度表達與滑膜細胞增生有密切關系。本研究中，筆者借助熒光定量PCR對VEGF、TGF-β1 mRNA表達進行定量分析，結果顯示，與模型組相比，各治療組VEGF、TGF-β1 mRNA表達均顯著低于模型組，并且聯合治療組大鼠關節滑膜組織中VEGF、TGF-β1 mRNA表達的降低程度顯著高于甲氨蝶呤組和雷公藤組，提示甲氨蝶呤和雷公藤多苷可能通過抑制滑膜細胞的過度增生，抑制血管翳的形成，減輕軟骨與骨的破壞，起到阻止關節炎病程進展的作用，而且當二者聯合作用時抑制效果更佳。

綜上所述，甲氨蝶呤聯合雷公藤多苷治療RA能最大限度地發揮藥物的協同作用，提高療效，進而緩解和阻止RA的進展作用，其作用機制可能是通過減輕細胞因子對滑膜細胞的刺激和抑制關節滑膜組織內VEGF、TGF-β1的基因表達來實現的。

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·綜述·

·文獻分析·

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1004-745X（2016）04-0655-04

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.04.029

收稿日期（2015-10-29）