活血榮絡片對AD模型小鼠AchE和ChAT表達的影響*

李　珊　胡　華　　周德生（.湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙40007；.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南長沙40007）

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活血榮絡片對AD模型小鼠AchE和ChAT表達的影響*

李珊1胡華2△周德生2
（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410007）

【摘要】目的觀察活血榮絡片對阿爾茨海默?。ˋD）小鼠腦組織乙酰膽堿酯酶（AchE）和乙酰膽堿轉移酶（ChAT）表達的影響。方法將50只APP/PS1雙轉基因AD模型小鼠隨機分為模型組、低劑量活血榮絡片組、中劑量活血榮絡片組、高劑量活血榮絡片組、多奈哌齊組，每組10只。同期將同月齡的10只KM小鼠作為正常組。每天灌胃1次，連續(xù)治療2個月。治療結束后，取各組小鼠腦組織，采用Western Blot檢測AchE和ChAT蛋白含量。結果與正常組相比，AD模型組小鼠腦組織AchE蛋白表達提高、ChAT蛋白表達降低（P＜0.01）；與模型組相比，低中高劑量活血榮絡片組、多奈哌齊組腦組織AchE蛋白表達降低、ChAT蛋白表達增高（P＜0.01）；與多奈哌齊組比較，中、高劑量活血榮絡片組降低AchE蛋白表達的變化無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而高劑量活血榮絡片組提高ChAT蛋白的表達（P＜0.05）。結論活血榮絡片可一定程度上抑制AD模型小鼠腦組織AchE蛋白的表達并促進ChAT蛋白的表達。

【關鍵詞】活血榮絡片阿爾茨海默病乙酰膽堿酯酶乙酰膽堿轉移酶

阿爾茨海默?。ˋD）極大地影響著人群的健康。近年來，隨著急性腦卒中發(fā)病率的增加，也增加了AD的發(fā)病率，加快了疾病的進展，使AD成為腦血管意外后的主要后遺癥之一［1］。目前AD確切病機尚不明確，暫無特效治療方法，乙酰膽堿的缺失被認為是重要的病因。研究表明［2］AD患者腦內(nèi)乙酰膽堿（Ach）水平下降迅速，乙酰膽堿的缺乏與認知功能障礙密切相關。本課題組前期研究顯示，活血榮絡片可一定程度上改善患者學習及記憶能力，并抑制AD小鼠腦組織β淀粉樣蛋白（Aβ）的沉積。本研究在前期研究基礎上，從乙酰能代謝角度探討活血榮絡片對AD模型小鼠腦組織乙酰膽堿酯酶（AchE）和乙酰膽堿轉移酶（ChAT）表達的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物KM小鼠，體質量（20±2）g，SPF級，鼠齡5月，雌雄各半，由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（湘）2011-0003。APP/PS1雙轉基因小鼠，體質量（20±2）g，SPF級，鼠齡5個月，雌雄各半，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所，許可證號：SCXK（京）2008-0025。APP/PS1雙轉基因AD模型小鼠隨年齡的增加會出現(xiàn)類似AD的病理改變，是公認的研究AD防治的轉基因動物模型［3］。小鼠均飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學SPF級動物實驗中心，室溫24～26℃，濕度55%～60%，光照時間8∶00～20∶00。自由飲水進食，定期更換墊料，適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。

1.2試劑與儀器主要試劑包括鼠抗AchE單克隆抗體，鼠抗ChAT單克隆抗體，羊抗鼠二抗，RIPA蛋白裂解液（圣克魯斯生物技術有限公司）；彩色預染蛋白marker，超敏化學放光顯色試劑盒（江蘇碧云天生物技術有限公司）；羊抗鼠二抗（美國vazyme公司）。主要儀器包括手術器械；-80℃冰箱；灌胃針、燒杯、量筒等；AE-240精密分析天平（瑞士Mettler公司）；MIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)（北航公司）；LEICADMLBZ型雙目顯微鏡（德國LEICA公司）；DYY-6C電泳儀、DYCZ-24D垂直板電泳槽、DYCP-40C水平電轉槽、WD-9405B水平搖床均購自于北京六一儀器廠；THZ-82A恒溫搖床（金壇公司）；SP-752紫外可見分光光度計（上海spectrum公司）。

1.3實驗藥物活血榮絡片由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑科提供，湘藥制字Z20080472，規(guī)格：0.35 g/片，100片/瓶，每片含生藥量0.14 g。將藥片放入蒸餾水中溶解，低、中、高劑量組分別配成0.275 g/kg（相當于生藥量0.11 mg/kg）、0.55 g/kg（相當于生藥量0.22mg/kg）、1.10g/kg（相當于生藥量0.44 mg/kg）的藥液。多奈呢齊片：陜西方舟制藥有限公司，國藥準字號H20030583，生產(chǎn)批號：130901，規(guī)格：5 mg/片，7片/盒。將藥片放入蒸餾水中溶解，配成0.65 mg/kg的藥液。以上藥液放入冰箱中保存，給藥前在室溫下放置30min，搖勻后灌胃。

1.4分組與給藥50只APP/PS1雙轉基因AD模型小鼠，隨機分為模型組、低劑量活血榮絡片組、中劑量活血榮絡片組、高劑量活血榮絡片組、多奈哌齊組，每組10只。同期將同月齡的10只KM小鼠作正常組。正常組、模型組予蒸餾水灌胃，低、中、高劑量活血榮絡片組予相應劑量活血榮絡片藥液灌胃。多奈哌齊組予多奈哌齊藥液灌胃。灌胃量按0.1 mL/10g給予，每天灌胃1次，下午4～5時執(zhí)行，連續(xù)處理2個月（相當于AD早中期）。

1.5標本采集與檢測治療結束后取材，各組小鼠腦組織用液氮冰凍保存。組織勻漿后，BCA法測定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質，配制12%分離膠，3%的濃縮膠，80V恒壓電泳30min后，電壓增加至120V恒壓電泳60min；電泳結束后進行轉膜，條件電壓80V轉膜2.5 h；5%脫脂奶粉封閉1 h；一抗4℃孵育過夜；二抗室溫下孵育1～2h；洗膜4次，每次10min；向膜上均勻滴加ECL液，平穩(wěn)地將顯色板放入Image Quant 350化學發(fā)光系統(tǒng)，曝光顯色；Image J軟件分析灰度值。

1.6統(tǒng)計學處理應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（±s）表示。所有資料進行正態(tài)性檢驗。符合正態(tài)分布者，多組比較采用單因素方差分析。不符合正態(tài)分布者，采用多個獨立樣本比較的秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結　果

2.1各組小鼠腦組織中AchE的含量比較見表1，圖1。與正常組比較，模型組小鼠腦組織AchE/β-actin相對灰度值明顯增高（P＜0.01）；與模型組比較，低、中、高劑量活血榮絡片組和多奈哌齊組小鼠腦組織AchE/β-actin相對灰度值降低（P＜0.01）；與多奈哌齊組比較，低劑量活血榮絡片組小鼠腦組織AchE/βactin相對灰度值增加（P＜0.05），而中、高劑量活血榮絡片組AchE/β-actin相對灰度值變化無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1　各組小鼠腦組織AchE/β-actin相對灰度值的比較（±s）

表1　各組小鼠腦組織AchE/β-actin相對灰度值的比較（±s）

與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與多奈哌齊組比較，#P＜0.05。下同。

組別　n正常組　10模型組　10低劑量活血榮絡片組　10AchE/β-actin相對灰度值0.122±0.1031.520±0.132**1.186±0.217**△△#中劑量活血榮絡片組　10　0.416±0.161**△△高劑量活血榮絡片組　10　0.332±0.121**△△多奈哌齊組　10　0.460±0.263**△△

圖1　小鼠腦組織AchE蛋白表達情況

2.2各組小鼠腦組織中ChAT的含量比較見表2，圖2。與正常組比較，模型組小鼠腦組織ChAT/β-actin相對灰度值明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，低、中、高劑量活血榮絡片組和多奈哌齊組小鼠腦組織ChAT/β-actin相對灰度值增高（P＜0.01）；與多奈哌齊組比較，高劑量活血榮絡片組小鼠腦組織ChAT/βactin相對灰度值增加（P＜0.05），而低、中劑量活血榮絡片組ChAT/β-actin相對灰度值變化無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2　各組小鼠腦組織ChAT/β-actin相對灰度值的比較（±s）

表2　各組小鼠腦組織ChAT/β-actin相對灰度值的比較（±s）

組別　n正常組　10模型組　10低劑量活血榮絡片組　10ChAT/β-actin相對灰度值1.224±0.414 0.453±0.162**0.755±0.208**△△中劑量活血榮絡片組　10　0.865±0.225**△△高劑量活血榮絡片組　10　0.943±0.280**△△#多奈哌齊組　10　0.865±0.167**△△

圖2　小鼠腦組織ChAT蛋白表達情況

3　討　論

阿爾茨海默病的發(fā)病機制復雜，病因尚不明確，但目前大多學者支持膽堿能假說，認為Ach的缺失是致病的關鍵原因［4］。研究顯示［5］腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元退變是造成AD最重要的病理因素之一，膽堿能系統(tǒng)與記憶的形成、存儲有關，與學習記憶能力亦密切相關，膽堿能系統(tǒng)的損傷能引起學習、記憶的減退。Ach作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質之一，與AD患者的癡呆嚴重程度緊密相關。大多數(shù)學者的研究表明［6］Ach活性在AD患者的大腦中明顯降低，同時在AD早期也發(fā)現(xiàn)了膽堿能缺少的臨床表現(xiàn)，并且增加腦內(nèi)Ach水平能夠有效改善記憶功能。

研究顯示［7］，機體通過多方面的調(diào)節(jié)方式對學習、記憶進行調(diào)控，中樞膽堿能系統(tǒng)作為重要的通路發(fā)揮重要作用，與學習、記憶密切相關，該通路的核心便是Ach這一重要的神經(jīng)遞質。Ache對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)是雙向的，既有興奮作用也有抑制作用，但以興奮作用為主，參與皮層喚醒、情緒和運動的協(xié)調(diào)等生理過程，特別是學習記憶方面被認為是關鍵環(huán)節(jié)。Ach在腦內(nèi)分布廣泛，其合成與代謝分解與ChAT和AchE密切相關，兩者共同作用維持Ach含量的動態(tài)平衡，同時兩者的活性也反映了Ach的合成和代謝速率。患者腦內(nèi)AchE和ChAT活性變化被認為是AD的重要生化特征。多項研究表明［8-9］，Ach分解加速，嚴重影響學習記憶和認知能力；同時發(fā)現(xiàn)老年性癡呆患者Ach合成明顯減少，ChAT的活性下降，與癡呆的嚴重程度相關。所以選取AchE和ChAT作為研究對象，間接評價Ach含量變化。

活血榮絡片為周德生教授經(jīng)驗方。癡呆病位在腦絡，發(fā)病與腎虛、氣虛、氣滯、肝郁、痰濁相關，但不論那種皆可“致瘀”，故“祛瘀通絡”是治療關鍵?；钛獦s絡片含石菖蒲、雞血藤、玄參、黃精、生地黃、乳香、川芎、沒藥等，重在祛瘀通絡。方中川芎、雞血藤、乳香、沒藥、石菖蒲活血行氣，化痰解毒，使腦髓純凈，腦絡通暢；輔以黃精、玄參、生地黃健脾益腎，滋養(yǎng)陰氣，化生腦髓，腦絡得養(yǎng)?，F(xiàn)代藥理已證明上述藥物多具有改善循環(huán)、促智的作用［10］。同時，相關研究還顯示［11-12］活血類方劑能明顯增高AD大鼠的AchE的含量，提高ChAT活性，降低腦內(nèi)AchE活性，從而增加Ach含量，保護大腦學習記憶能力，對中樞膽堿能損害有一定的修復作用，從而達到改善學習記憶的目的。

本研究中，模型組大幅度提高小鼠腦組織AchE的表達量，降低了ChAT的表達。低、中、高劑量活血榮絡片組、多奈哌齊組均能不同程度的降低腦組織中AchE的含量并提高ChAT的含量，從而一定程度上促進Ach蓄積，進而具有延緩癡呆病程的可能，且中、高劑量活血榮絡片組降低AchE表達量的效果與多奈哌齊組相當，高劑量活血榮絡片組提高ChAT的含量優(yōu)于多奈哌齊組。近年來，多項研究亦顯示［13-15］，通過一定的干預手段對AD模型動物膽堿能系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)，即提高腦組織中ChAT活性，抑制AchE活性，增加Ach的含量，可減輕大鼠學習記憶功能，改善癡呆癥狀，進而減輕對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一定的保護作用。本次實驗中，通過不同劑量活血榮絡片灌胃處理，影響了AD模型小鼠體內(nèi)AchE和ChAT蛋白的表達，進而起到提高Ach含量的作用，可能與活血榮絡片影響機體內(nèi)環(huán)境的變化有關。由于本研究僅從膽堿能遞質途徑的表達入手，為活血榮絡片的臨床應用提供一定的實驗依據(jù)，仍需進一步研究。

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中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1004-745X（2016）03-0393-04

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.03.006

*基金項目：湖南省自然科學基金（14JJ6038）；湖南省科技廳課題（2014sk3037）

通信作者△（電子郵箱：hh201201201＠163.com）

收稿日期（2015-11-28）

Effect of Huoxue Rongluo Tablets on the Expression of ChAT and AchE in AD Model Mice

LI Shan，HU Hua，ZHOU Desheng.
Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410007，China.

【Abstract】Objective：To investigate the effect of Huoxue Rongluo Tablets on the expression of acetylcholinesterase（AchE）and acetylcholine transferase（ChAT）in brain tissue of mice with Alzheimer′s disease （AD）.Methods：50APP/PS1 transgenic AD model mice were randomly divided into five groups，with10rats in each.10KM mice with the same age were chosen as the normal group.The stomach was filled once a day，and continuous treatment lasted for 2months.After treatment，the brain tissues of mice were taken to detect the content of AchE and ChAT with Blot Western.Results：Compared with the normal group，the expression of AchE protein in brain tissue of mice in AD model group increased，and the expression of ChAT protein decreased（P＜0.01）.Compared with the model group，AchE protein expression in brain tissue of low，middle and high dose of Huoxue Rongluo Tablets group and donepezil group decreased and the expression of choline acetyltransferase protein increased（P＜0.01）.Compared with Donepezil group，the reduce of AchE protein expression in middle and high dose of Huoxue Rong luo decoction group had no statistical significance（P＞0.05），and high dose of Huoxue Rongluo Tablets group improved ChAT protein expression（P＜0.05）.Conclusion：The expression of AchE protein in brain tissue of AD model mice can be inhibited to a certain extent and ChAT protein can be promoted with Huoxue Rongluo Tablets.

【Key words】Huoxue Rongluo Tablets；Alzheimer disease；Acetylcholinesterase；Acetylcholine transferase