防己黃芪湯對阿霉素腎病大鼠腎組織乙酰肝素酶表達的影響*

符　強　黃亞仙　王聞婧（.黑龍江中醫藥大學基礎醫學院，黑龍江哈爾濱50040；2.湖北中醫藥大學，湖北武漢43006）

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防己黃芪湯對阿霉素腎病大鼠腎組織乙酰肝素酶表達的影響*

符強1黃亞仙1王聞婧2△
（1.黑龍江中醫藥大學基礎醫學院，黑龍江哈爾濱150040；2.湖北中醫藥大學，湖北武漢430061）

【摘要】目的觀察防己黃芪湯對阿霉素腎病大鼠腎小球濾過功能的作用，探討該方減少蛋白尿，治療腎小球疾病的可能機制。方法尾靜脈注射阿霉素法建立阿霉素腎病大鼠模型，成模后，根據24 h尿蛋白定量隨機分為模型組、防己黃芪湯高、低劑量治療組，連續給藥5周，分別測定各組大鼠24 h尿蛋白定量及腎組織乙酰肝素酶（HPA）表達。結果模型組大鼠24 h尿蛋白定量和腎組織HPA表達升高明顯高于正常組（P＜0.05）；與模型組比較，防己黃芪湯高、低劑量治療組24 h尿蛋白定量和腎組織HPA表達均明顯改善（P＜0.05）。結論防己黃芪湯減少模型大鼠尿蛋白的作用可能與調節腎組織HPA表達，保護足細胞受損有關。【關鍵詞】阿霉素腎病防己黃芪湯乙酰肝素酶

研究表明，防己黃芪湯在治療慢性腎臟病方面可通過修復受損腎小球濾過屏障，恢復濾過功能，達到保護腎功能的作用。本實驗旨在觀察該方對阿霉素腎病大鼠24 h尿蛋白定量、腎組織乙酰肝素酶（HPA）表達的影響，為其臨床應用提供一定的實驗依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物清潔級Wistar雄性大鼠，48只，體質量100～150g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.2藥物與試劑防己黃芪湯組成及劑量：防己20g，黃芪25 g，白術7.5 g，炙甘草10g。上述飲片由黑龍江中醫藥大學國醫堂提供，加水500mL，浸泡30min，煎煮30min，濾出藥渣，再次加水400min煎煮45 min，將2次煎取液合并混勻，恒溫60℃條件下濃縮至含生藥量5.63 g/mL。4℃保存，使用前加溫至37℃。阿霉素注射液（鹽酸多柔比星）規格：10mg/支（Pfizer Italia S.r.l.，批號2QL0036），購于哈藥集團醫藥有限公司。逆轉錄酶試劑盒：PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit（Takara，D6210A）。

1.3造模與分組實驗大鼠適應性飼養1周，隨機留取8只為正常組，其余40只大鼠制作阿霉素腎病模型：阿霉素注射液（鹽酸多柔比星）按2.75 mL/kg（5.5 mg/kg）和1.5 mL/kg（3 mg/kg）的劑量進行2次尾靜脈注射，2次間隔時間為2周。造模結束，根據每只成模大鼠24 h尿蛋白定量隨機分組，各組分離飼養。實驗共分4組：正常組、模型組、防己黃芪湯高劑量治療組和防己黃芪湯低劑量治療組。

1.4給藥方法治療組劑量折算方法：低劑量組按臨床等效量折算（1 mL/100g），高劑量組為臨床等效量2倍（2mL/100g），模型組和正常組予等量蒸餾水灌胃。給藥時間均為連續5周。

1.5標本采集及檢測大鼠分別置代謝籠24 h，收集全部尿液，測定尿蛋白量。每組隨機選取3只大鼠，脫頸椎處死后，取左側腎臟，液氮凍存。1）24 h尿蛋白定量［1］。采用磺柳酸-硫酸鈉法。2）腎組織HPA mRNA表達。采用RT-PCR法。提取各組樣本總RNA，采用核酸蛋白分析儀分別測定不同組樣品所提RNA濃度，分別取相同量RNA為模板（本實驗所取RNA量為1 μg），對目的基因HPA和內參基因β-actin行逆轉錄反應，取反應產物1.5 μL行PCR擴增。分別取相同體積的PCR擴增產物6μL進行電泳，電泳后用凝膠成像系統進行成像分析。HPA引物序列：上游5′-CAGCAGG ACACGTCATCATCA-3′，下游5′-TGCAGCCATCACAT GACCA-3′。β-actin引物序列：上游5′-CAACCGTGAAAAGATGACCCA-3′，下游5′-AATGCCAGTGGT ACGACCAGA-3′。

1.6統計學處理采用SPSS17.0統計軟件分析。計量數據以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1各組24 h尿蛋白定量比較見表1。與正常組比較，模型組大鼠24 h尿蛋白定量明顯升高（P＜0.05），說明造模成功；與模型組比較，防己黃芪湯高、低劑量組大鼠尿24 h蛋白量則明顯減少（P＜0.05）。

表1　各組大鼠24 h尿蛋白定量比較（mg，±s）

表1　各組大鼠24 h尿蛋白定量比較（mg，±s）

與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別　n 24 h尿蛋白定量正常組　3模型組　3防己黃芪湯低劑量組　3 23.77±1.63△76.73±39.87 27.31±18.48△防己黃芪湯高劑量組　347.35±22.63△

2.2腎組織HPA mRNA表達見圖1，表2。與正常組比較，模型大鼠HPA mRNA表達明顯增加（P＜0.05）。防己黃芪湯高、低劑量治療組與模型組比較HPA mRNA表達下降（P＜0.05），兩治療組組間差異不明顯。

3　討　論

防己黃芪湯是治療表虛水腫的代表方劑，臨床用于治療腎臟系統疾病較多。近年來已有該方減少蛋白尿的臨床和實驗研究報告，表明其在減少腎小球疾病患者蛋白尿，改善其臨床癥狀，從而延緩其腎功能下降方面有良好作用，所以有必要進一步探討其作用機制［2-4］。

M，100bp marker（從下到上分別為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1500bp），1.正常組；2.防己黃芪湯低劑量組；3.防己黃芪湯高劑量組；4.模型組

表2　各組大鼠腎組織HPA mRNA表達（±s）

表2　各組大鼠腎組織HPA mRNA表達（±s）

組別　n　表達相對系數β-actin基因光密度　HPAmRNA光密度正常組　3　0.7996±0.063模型組　3　1.2816±0.171防己黃芪湯低劑量組　3　1.0968±0.054 2680560　2109560△3644208　4490304 2874444　3113806△防己黃芪湯高劑量組　3　0.8507±0.025 2408625　2117360△

蛋白尿是各種腎臟疾病共有的臨床表現，尿中蛋白質的量和持續時間直接反映腎小球濾過功能和腎小管重吸收功能的好壞，所以蛋白尿成為評價治療腎臟疾病藥物療效的重要指標，能有效降低24 h尿蛋白定量是大多數腎臟病治療的首要任務。本研究組已有研究結果表明，防己黃芪湯可以通過減少阿霉素腎病大鼠腎組織Podocin及Nephrin表達，保護模型大鼠腎小球濾過功能［5-6］。從本次實驗結果看，阿霉素造模后，大鼠尿蛋白量明顯增加，說明其腎小球濾過功能被嚴重破壞。治療組大鼠尿蛋白排出量減少，但組間比較并無明顯差異，未見明顯量效關系。

3.2防己黃芪湯對阿霉素腎病大鼠腎組織HPA基因表達的影響腎小球濾過屏障（GFB）包括電荷屏障和機械屏障，其各組分的損傷及其相互作用障礙，均參與蛋白尿的形成［7］。其中腎小球基底膜（GBM）主要承擔電荷屏障作用。GBM上有多種蛋白與腎小球濾過功能相關，硫酸肝素蛋白多糖（HSPG）是其中之一，由此蛋白為主要成分所構成的陰離子位點使腎小球濾過膜具備電荷屏障［8-10］。HSPG相連形成帶有多量負電荷的硫酸肝素（HS）多糖鏈，這決定了GBM的電荷選擇通透性［11-12］。因此，各種病因破壞濾過膜上的HS，破壞腎小球上皮細胞與內皮細胞的錨連位點，會使濾過膜電荷選擇性降低，導致濾過屏障功能異常［13］。HPA是一種可特異性水解HS，降解HSPG上HS多糖鏈的內切葡糖醛酸酶，HS水解后，腎小球的電荷屏障被破壞，導致蛋白尿的出現和增加［12-13］。相反，GBM上的HPA表達減少，濾過膜電荷選擇性得到保護，蛋白尿可相應減少［14］。從本次實驗結果看，HPA在正常大鼠腎組織上僅有微量表達。模型大鼠表達則明顯增加。防己黃芪湯治療組大鼠腎組織HPA基因水平降低，表明該方可通過降低腎組織HPA基因表達對阿毒素腎病大鼠腎小球濾過膜的電荷屏障產生保護作用。

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中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1004-745X（2016）03-0387-03

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.03.004

*基金項目：黑龍江省教育廳科學技術研究項目（12541750）

通信作者△（電子郵箱：yangjian13r＠163.com）

收稿日期（2015-11-13）

Effects of Fangji Huangqi Decoction on the Expression of Heparanase Adriamycin Nephropathy

FU Qiang，HUANG Yaxian，WANG Wenjing.
Heilongjiang University of Chinese Medicine，Heilongjiang，Harbin150040，China.

【Abs tract】Objective：To study the protection of Fangji Huangqi Decoction on the Adriamycin Induced Nephropathy（AIN）rats and explore its mechanism.Methods：Wistar rats were given intravenous injections of ADR via tail vein，establishing adriamycin-induced nephropathy rat model.The model rats were randomly divided into the model group and the treatment groups of high-dosage and low-dosage medicine，and were then administered intragastrically by medicine in corresponding dosage.In next 5 weeks，rats in each group were detected in 24 hours urinary protein.Renal tissues routine was fixed，and heparanases expression was detected with reverse transcription PCR.Result：Those indices in the modle group were higher obviously than those in the routine group including the 24 hours urinary protein and the renal tissue HPA.However，these indicators of the highdosage and low-dosage medicine group were improved signifcantly than the modle group（P＜0.05）.Conclusion：Fangji Huangqi Decoction can reduce the quantity of 24 hours urine protein of Adriamycin Induced Nephropathy rats，and protect the glomerular filtration barrier by moderating the expression of heparanases.

【Key words】Adriamycin nephropathy；Fangji Huangqi Decoction；Heparanase