基于對miR-133的調(diào)控探討丹參酮ⅡA影響鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶介導(dǎo)的心肌肥厚的作用機(jī)制*

馮　俊　李樹生　陳華文（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，湖北武漢430030）

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基于對miR-133的調(diào)控探討丹參酮ⅡA影響鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶介導(dǎo)的心肌肥厚的作用機(jī)制*

馮俊李樹生陳華文
（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，湖北武漢430030）

【摘要】目的探討丹參酮ⅡA是否可通過miR-133影響鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶途徑來改善胸主動脈縮窄法（TAC）誘導(dǎo)大鼠的心肌肥厚。方法60只SD大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、手術(shù)組和丹參酮ⅡA治療組。檢測各組超聲和心室體質(zhì)量比、miR-133、調(diào)節(jié)性鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶作用蛋白1（MCIP1）、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（Calcineurin）的表達(dá)及32P的釋放情況（P-release）。結(jié)果1）除射血分?jǐn)?shù)（EF）外，手術(shù)組的指標(biāo)均與其余兩組有差異，丹參酮ⅡA組的心肌肥厚有顯著的改善；2）手術(shù)組的MCIP1和miR-133水平均與其余兩組比較均有顯著性差異（P＜0.05），丹參酮ⅡA組MCIP1水平明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），miR-133水平低于假手術(shù)組（P＜0.05）；3）手術(shù)組的Calcineurin的蛋白水平顯著高于其余兩組（P＜0.01），丹參酮ⅡA組與假手術(shù)組比較無明顯差異；4）手術(shù)組的32P釋放均高于其余兩組（P＜0.01），丹參酮ⅡA組32P釋放高于假手術(shù)組（P＜0.05）。結(jié)論丹參酮ⅡA可以有效的逆轉(zhuǎn)手術(shù)組誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚，其機(jī)制與調(diào)控miR-133進(jìn)而降低Calcineurin相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】心肌肥厚丹參酮ⅡA miR-133鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶途徑

心肌肥厚是在長期壓力負(fù)荷過重的情況下心肌的代償適應(yīng)，機(jī)體主要通過增加心肌總量來加強(qiáng)心臟的收縮能力，維持正常的血循環(huán)，但隨著肥大的心肌需氧的增加，會導(dǎo)致供血量不足，最終發(fā)展為心肌缺血［1］。丹參酮ⅡA是從丹參中提取的脂溶性的藥效成分。目前的研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA對于左心室肥厚、血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥大、壓力超負(fù)荷大鼠心肌肥厚、腹主動脈縮窄高血壓大鼠的心肌肥厚均有較好的逆轉(zhuǎn)作用，推測其機(jī)制為鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路、miR-133的影響［2-7］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)心肌肥厚大鼠的心臟Calcineurin的表達(dá)和活性上調(diào)，同時miR-133的表達(dá)下降，同時采取減弱Calcineurin的表達(dá)和活性或者增強(qiáng)miR-133表達(dá)的方法可有效干預(yù)心肌肥厚［7］。Dong等研究表明，miR-133和Calcineurin在調(diào)節(jié)心肌肥厚上有相互抑制的作用［7］。因此，本課題組推測丹參酮ⅡA是通過miR-133來影響鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶途徑從而逆轉(zhuǎn)心肌肥大。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗動物6.0只雄性SPF級SD大鼠均購買于北京維通利華公司（實(shí)驗動物使用許可證號：SCXK京2002-0003），體質(zhì)量為280～300g。

1.2藥物與試劑丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液（上海第一生化藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號Z20026249），Calcineurin和GADPH的一抗和二抗均購買于Santa Cruz公司（Santa Cruz，CA），底物肽由Sigma公司特約合成，RNA assay kits和熒光定量試劑盒購買于Promega公司，其他的試劑均為分析純。

1.3分組與造模大鼠隨機(jī)分為：假手術(shù)組、手術(shù)組和丹參酮ⅡA治療組。假手術(shù)組：僅進(jìn)行開胸處理，不縮窄胸主動脈。手術(shù)組：采用腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/kg）進(jìn)行麻醉，通過氣管切開術(shù)進(jìn)行機(jī)械通氣，在左側(cè)第2肋水平處開胸，暴露無名動脈和左側(cè)頸總動脈區(qū)域，采用8號針頭與胸主動脈并行，并用4-0手術(shù)絲線將兩者結(jié)扎，將針頭抽出即可，進(jìn)行后續(xù)手術(shù)。丹參酮ⅡA組：除了進(jìn)行胸主動脈縮窄術(shù)外，并在手術(shù)前1周開始每天給予20mg丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液處理（腹腔注射）。假手術(shù)組和手術(shù)組分別每天給予同等容體積的無菌生理鹽水腹腔注射，每天1次。在造模后共治療8周。

1.4標(biāo)本采集與檢測1）心臟超聲檢查及心室體質(zhì)量比測量。在手術(shù)8周后進(jìn)行超聲檢查，主要有大鼠左心室后壁厚度（LVPW）、室間隔厚度（IVs）、射血分?jǐn)?shù)（EF）和縮短分?jǐn)?shù)（FS）。待超聲檢查完成后取出心臟，PBS緩沖液沖洗濾紙擦干后，保留大鼠的左心室和室間隔，用電子天平稱質(zhì)量，并計算左心室體質(zhì)量比（LVW/BW）。并將左心室保存在-80℃冰箱內(nèi)，進(jìn)行下一步實(shí)驗。2）Real-time PCR檢測。采用Promega公司的RNA assay kits抽提試劑盒提取大鼠左心室RNA，并采用紫外分光光度計進(jìn)行RNA的定量，純化后的RNA被分成兩份，分別用于目的基因和管家基因的檢測。每個樣本取1 mg的RNA在M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行cDNA的合成。采用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行cDNA的擴(kuò)增，熒光定量PCR檢測試劑盒包括擴(kuò)增的所有試劑，如taqman探針和熒光定量PCR試劑。Roche lightcycler熒光儀的程序設(shè)置1個循環(huán)（94℃× 3 min），40個循環(huán)（94℃×5 s+60℃×20s）。采用ΔΔCt法來分析實(shí)時定量擴(kuò)增的效果，miR-133和MCIP1的擴(kuò)增cDNA水平為與GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)化處理，結(jié)果均以2-ΔΔCT來表示。miR-133的引物為：上游5′-UUGGUCCCCUUCAACCAGCUGU-3′，下游5′-AGCUGGUUGAAGGGGACCAAAU-3′。MCIP1（No：NM_153724）的引物為：上游5′-CAAGCGTGTCCGA ATAAAC-3′，下游5′-TGTAAAGTCTGGGCAAAGT-3′。GAPDH的引物為：上游5′-TGCACCACCAACTGCTTAT-3′，下游5′-GGATGCAGGGATGATGTTC-3′。3）Western bolt檢測。PBS沖洗大鼠心肌組織，加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行組織勻漿處理，離心處理留上清，采用BCA法測量其蛋白濃度。并采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法進(jìn)行蛋白的電泳分離，半干轉(zhuǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，采用5%脫脂牛奶將PVDF膜封閉，室溫下?lián)u床處理1 h，并與TBST稀釋（1∶1000）的Calcineurin一抗（兔抗鼠單克隆抗體）孵育4℃過夜，TBST洗膜3次后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶5000）共同孵育1 h，采用ECL法來顯色處理，膠片曝光后觀察蛋白的條帶。然后將膜上洗脫，重復(fù)上述步驟，進(jìn)行GADPH蛋白的條帶顯影。Calcineurin的蛋白水平以與GADPH的光密度比值來表示。4）放射性同位素法檢測。將20μL的左心室提取液與32P標(biāo)記的底物肽混合，共同孵育15 min（30℃）后，采用100mmol/L的磷酸鉀緩沖液終止反應(yīng)。采用Dowex陽離子交換層子柱分離游離的無機(jī)磷酸，并通過液體閃爍計數(shù)法計數(shù)。并將結(jié)果與不含有calcineurin的對照組的差值作為P的釋放情況。底物肽的序列為：Asp-Leu-Asp-Val-Pro-Ile-Pro-Gly-Arg-Phe-Asp-Arg-Arg-Val-Ser-Val-Ala-Ala-Glu。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件處理，計數(shù)資料以（±s）表示，符合正態(tài)分布、方差齊者采用t檢驗，不符合正態(tài)分布者，采用秩和檢驗。計量資料用χ2檢驗或非參數(shù)檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1心臟超聲檢查及左心室體質(zhì)量比測量見表1。3組手術(shù)8周后的超聲情況表明，除了EF外，手術(shù)組的指標(biāo)均與其余兩組有明顯差異（P＜0.05），丹參酮ⅡA組在BW和LVW/BW上與假手術(shù)組有明顯差異（P＜0.05），但其LVW/BW水平仍低于手術(shù)組（P＜0.05）。

表1　各組心臟超聲檢查及左心室體質(zhì)量比比較（±s）

表1　各組心臟超聲檢查及左心室體質(zhì)量比比較（±s）

與假手術(shù)組比較，△P＜0.05；與手術(shù)組比較，▲P＜0.05。下同。

組別　LVPW（mm）Ivs（mm）　EF（%）　FS（%）HW（g）BW（g）　LVW/BW（mg/g）假手術(shù)組　1.88±0.06手術(shù)組　2.69±0.05△1.83±0.1254.72±6.93 93.34±7.122.89±0.15△51.46±6.75 75.23±5.68△1.15±0.031.89±0.05△493.17±14.03　2.21±0.03 425.49±11.72△3.49±0.05△丹參酮IIA組1.94±0.08▲2.03±0.09▲54.48±7.98 88.77±6.59▲1.32±0.04▲454.55±13.91△▲　2.75±0.06△▲

2.2各組MCIP1 mRNA及miR-133表達(dá)水平比較見表2。結(jié)果顯示，手術(shù)組的MCIP1水平明顯高于其余兩組（P＜0.05），丹參酮ⅡA組的MCIP1水平明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05）。手術(shù)組的miR-133均低于其余兩組（P＜0.05），丹參酮ⅡA組的miR-133水平低于假手術(shù)組（P＜0.05）。

表2　各組MCIP1、miR-133 Calcineurin及P釋放情況比較（±s）

表2　各組MCIP1、miR-133 Calcineurin及P釋放情況比較（±s）

組　別　MCIP1（2-ΔΔCT）P釋放miR-133（2-ΔΔCT）Calcineurin蛋白水平假手術(shù)組　2.31±0.02　0.62±0.05手術(shù)組　17.82±0.42△1.63±0.14△0.98±0.05　0.42±0.03 0.67±0.04△0.76±0.06△丹參酮ⅡA組　3.85±0.08△▲0.85±0.08△▲0.87±0.03△▲　0.45±0.04▲

2.3各組Calcineurin蛋白表達(dá)水平比較見表2。手術(shù)組Calcineurin的蛋白水平明顯高于其余兩組（P＜0.05），丹參酮ⅡA、假手術(shù)兩組之間Calcineurin表達(dá)無顯著差異。

2.4各組P的釋放情況比較見表2。手術(shù)組的P釋放明顯高于其余兩組（P＜0.05），丹參酮ⅡA組P釋放高于假手術(shù)組（P＜0.05）。

3　討　論

研究發(fā)現(xiàn)MicroRNAs已成為心肌肥大的重要調(diào)節(jié)因子，在大鼠心肌肥大模型和人心肌肥大病例的miR-133的表達(dá)下調(diào)，體外miR-133的過表達(dá)可有效的抑制心肌肥大，抑制其表達(dá)可誘導(dǎo)心肌肥大以及延緩病程發(fā)展［7］。綜合以上發(fā)現(xiàn)，有人建議miR-133可作為預(yù)測心肌肥大的一個必要條件。

Calcineurin是可由鈣和鈣調(diào)蛋白激活的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，可通過使轉(zhuǎn)錄因子去磷酸化，從而影響其與DNA的結(jié)合。Calcineurin可通過使活化T細(xì)胞核因子（NFAT）去磷酸化，繼而移位至細(xì)胞核并與DNA結(jié)合，激活心肌肥大反應(yīng)基因的表達(dá)。Molkentin等研究指出心肌特異性的激活Calcineurin或者其下游的NFAT是誘導(dǎo)心肌肥大的必要條件［8］。Dong等研究表明大鼠Calcineurin的過表達(dá)可導(dǎo)致伴隨鉀通道降低的急性心肌梗死［9］。壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚模型的Calcineurin和磷酸酶的活性升高。以上證據(jù)表明Calcineurin在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。

研究發(fā)現(xiàn)心肌肥厚大鼠的心臟Calcineurin表達(dá)和活性上調(diào)、miR-133表達(dá)下降，采取降低Calcineurin的表達(dá)和活性或者增強(qiáng)miR-133表達(dá)的方法可有效干預(yù)心肌肥厚［7，9-11］。Dong等證實(shí)了miR-133和Calcineurin在調(diào)節(jié)心肌肥厚上有相互抑制的作用［9］。這與本研究的發(fā)現(xiàn)一致，TAC組的miR-133水平降低，而Calcineurin水平升高，這表明miR-133和Calcineurin有一個相互的抑制作用。為了進(jìn)一步確認(rèn)和探討該現(xiàn)象的機(jī)制，筆者還研究了Calcineurin的一個調(diào)節(jié)因子MCIP1和代表Calcineurin活性的P釋放情況，且手術(shù)組的MCIP1表達(dá)上調(diào)和P釋放增強(qiáng)。本研究表明，模型大鼠經(jīng)丹參酮ⅡA處理后，丹參酮ⅡA組大鼠的miR-133水平高于手術(shù)組，這表明miR-133對于心肌肥厚有保護(hù)作用，但其水平也同樣高于假手術(shù)組，可能的原因是為了對抗造模處理后的心肌負(fù)荷加重導(dǎo)致的代償性反應(yīng)。丹參酮ⅡA組大鼠的Calcineurin的蛋白水平低于手術(shù)組，這表明丹參酮ⅡA可有效降低Calcineurin水平，且其水平與假手術(shù)組沒有差異。丹參酮ⅡA組的MCIP1水平低于手術(shù)組。以上的結(jié)果表明，丹參酮ⅡA主要是通過上調(diào)miR-133來影響Calcineurin，從而達(dá)到逆轉(zhuǎn)心肌肥厚的作用。同時丹參酮ⅡA組Calcineurin水平下降和P釋放減弱，這表明miR-133影響Calcineurin的機(jī)制為降低其含量和活性。

丹參酮ⅡA作為丹參的有效成分，在其預(yù)防和治療心血管疾病中發(fā)揮了重要的作用［12］。本研究發(fā)現(xiàn)其主要是通過miR-133影響鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶途徑來改善心肌肥大，這同樣也是臨床治療的一個突破口。

參考文獻(xiàn)

［1］馮俊，李樹生.丹參酮ⅡA抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)大鼠心肌肥大的機(jī)制［J］.高血壓雜志，2005，13（8）：488-451.

［2］潘春記，李萍.肌凋亡在心力衰竭發(fā)病機(jī)制中的作用［J］.中國社區(qū)醫(yī)師：醫(yī)學(xué)專業(yè)，2011，13（15）：74-75.

［3］李玉萍，顧兵，劉健濤，等.丹參酮ⅡA的研究進(jìn)展［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21（7）：1770-1772.

［4］劉光喜，黃韻詩.丹參對心血管作用的研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)藥導(dǎo)報，2008，14（3）：86-88.

［5］周亞光，屠恩遠(yuǎn)，王照華.丹參酮ⅡA對壓力超負(fù)荷大鼠心肌肥厚及MAPK通路的影響［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2010，39（1）：29-32.

［6］譚建新，陳新民，王優(yōu).鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路介導(dǎo)大鼠慢性缺氧性右心室心肌肥厚［J］.實(shí)用兒科臨床雜志，2008，23（13）：1002-1004.

［7］Dong DL，Chen C，Huo R，et al.Reciprocal repression between microRNA-133 and calcineurin regulates cardiac hypertrophy：a novel mechanism for progressive cardiac hypertrophy［J］.Hypertension，2010，55（4）：946-952.

［8］Molkentin JD，Lu JR，Antos CL，et al.A calcineurin-dependent transcriptional pathway for cardiac hypertrophy［J］.Cell，1998，93（2）：215-228.

［9］Dong D，Duan Y，Guo J，et al.Overexpression of calcineurin in mouse causes sudden cardiac death associated with decreased density of K+ channels［J］.Cardiovasc Res，2003，57 （2）：320-332.

［10］馮俊，李樹生，梁黔生，等.丹參酮ⅡA對心力衰竭大鼠的心肌凋亡及miR-133水平的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，32（7）：930-933.

［11］Ren ZH，Tong YH，Xu W，et al.Tanshinone II A attenuates inflammatory responses of rats with myocardial infarction by reducing MCP-1 expression［J］.Phytomedicine，2010，17（3-4）：212-218.

［12］馮俊，鄭智.丹參酮ⅡA對心肌細(xì)胞肥大及凋亡的影響［J］.中國臨床康復(fù)，2006，10（3）：69-71.

中圖分類號：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1004-745X（2016）03-0377-04

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.03.001

*基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（81202825）

收稿日期（2015-11-03）

Mechanism of Action of Tanshinone IIA on Attenuating the Hypertrophy Induced by Transverse Aortic Constriction（TAC）through Calcineurin Pathway Influenced by MiR-133

FENG Jun，LI Shusheng，CHEN Huawen.
Tongji Hospital affiliated to Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Hubei，Wuhan 430030，China.

【Abstract】Objective：To explore whether TanshinoneⅡA attenuates the hypertrophy induced by transverse aortic constriction（TAC）through calcineurin pathway influenced by miR-133.Methods：60rats were randomly divided into three groups：the sham group，TAC group and TAC+ TⅡA group.The protocols were described as followed：three groups received ultrasound examination and measurement of HW/BW；Real-time PCR was used to examine the level of miR-133 and modulatory calcineurin-interacting protein-1；western blot was employed to examine the level of calcineurin；isotopic tracer method was employed to examine the 32P release.Results：1）Except ejection fraction，all indexes of TAC were significantly different from the two groups（P＜0.05），while the cardiac hypertrophy was attenuated by the treatment with TanshinoneⅡA；2）The levels of MCIP1 and miR-133 in TAC were significant different from the other two groups（P＜0.05），and the levels of MCIP1 in TAC+ TⅡA was higher than the sham group；the levels of miR-133 in TAC+TⅡA was lower than the sham group；3）The protein level of calcineurin in TAC was higher than the other two groups（P＜0.05），and there was no significant difference between TAC+ TⅡA group and the sham group on the subject of calcineurin despite of an elevated trend.4）The p-release of TAC was higher than the other two groups（P＜0.01），and the p-release of TAC+ TⅡA was higher than the sham group（P＜0.05）.Conclusion：TanshinoneⅡA can effectively attenuate cardiac hypertrophy in TAC induced rats，and the effects is achieved by the influence of miR-133 on calcineurin pathways，which is mainly manifested in the deactivation of calcineurin.

【Key words】Cardiac hypertrophy；Tanshinone IIA；MiR-133；Calcineurin pathway